[发明专利]一种13C、15N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法

权利要求书

1.一种¹³C、¹⁵N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)发酵菌种的选取

选取适用于¹³C、¹⁵N双标记L-赖氨酸盐酸盐发酵生产的菌种包括短杆菌属及棒杆菌属的变异株，包括黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicium)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)或钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)等；

(2)发酵培养基配方

发酵培养基中不添加或添加极少量的玉米浆等作为有机氮源，有机氮源的浓度为0wt％～2.0wt％，以¹³C-葡萄糖为碳源，葡萄糖总的浓度为8wt％～15wt％，以含¹⁵N的硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或尿素中的一种或几种为初始氮源，初始氮源的添加量为氮元素含量占总量的0.3wt％～1.5wt％，发酵过程中可流加含¹⁵N的尿素或氨水补充氮源，不添加或添加极少量的玉米浆、豆饼水解液、酪蛋白水解液、菌体水解液中的一种或多种作为有机氮源，该有机氮源的浓度为0wt％～2.0wt％，随菌种不同添加不同量的磷酸盐包括K₂HPO₄或KH₂PO₄，添加量为0.5g/L～4g/L；镁盐，包括MgSO₄，添加量为0.2g/L～0.8g/L；亚铁盐，包括FeSO₄·7H₂O，添加量为0.01g/L～0.06g/L及锰盐，包括MnSO₄·4H₂O，添加量为0.01g/L～0.06g/L；另外添加高丝氨酸，添加量为0.05g/L～0.30g/L；生物素，添加量为100μg/L～1000μg/L；维生素B₁，添加量为100μg/L～1000μg/L等；

(3)发酵工艺

采用摇瓶发酵或发酵罐发酵得到发酵液，所述的摇瓶发酵的工艺：将菌体接种于活化培养基的斜面或平板上，在28～35℃的培养箱中培养16～24小时，再将长好的菌体接一环于经灭菌的发酵培养基中，500mL三角瓶的装液量为20～30mL，于摇床上进行连续发酵培养；所述的发酵罐发酵的工艺：将菌体接种于活化培养基的斜面或平板上，在28～35℃的培养箱中培养16～24小时，再将长好的菌体接种于经灭菌的种子培养基中，在28～35℃摇床培养16～24小时，摇床转速180～220转/分钟，得到的种子培养液按体积比3％～10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，进行发酵培养；

(4)分离提取

发酵培养结束后，将含有¹³C、¹⁵N双标记L-赖氨酸的发酵液采用离子交换法提取分离，得到¹³C、¹⁵N双标记L-赖氨酸的单斑洗脱液，经真空浓缩赶氨、脱色，所得滤液再浓缩后用乙醇和水进行结晶，再于50℃～60℃真空烘干，最终得到¹³C、¹⁵N双标记L-赖氨酸盐酸盐产品。

2.根据权利要求1所述的一种¹³C、¹⁵N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、种子培养基和发酵培养基。

3.根据权利要求2所述的一种¹³C、¹⁵N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，其特征在于，所述的斜面保藏培养基的组成成分为：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、NaCl 5.0g/L、琼脂20g/L。

4.根据权利要求2所述的一种¹³C、¹⁵N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，其特征在于，所述的斜面活化培养基的组成成分为：葡萄糖5.0g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、NaCl 5.0g/L、琼脂20g/L。