[发明专利]一种13C、15N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于稳定同位素标记化合物的生产制备领域，涉及微生物发酵工艺和生物下游分离领域，尤其是涉及一种¹³C、¹⁵N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法。

背景技术

传统的生产稳定同位素标记的L-氨基酸的方法可采用标记蛋白质分解分离制备法、有机合成法、酶法及微生物发酵法等。标记蛋白质分解分离制备法常用于制备标记的复合氨基酸，要分离得到标记的单一氨基酸很困难，现今由于受到原料限制已很少使用。采用有机合成法比较简单，但制备L-氨基酸需要光学拆分使¹³C、¹⁵N稳定同位素的原料利用率大为降低，成本上升。而酶法制备标记的L-氨基酸需得到标记的底物和可用的酶源，视具体的氨基酸而定。微生物发酵法则在合适的氨基酸产生菌的存在下辅以良好的生产工艺便可得到标记的氨基酸，有一定的优越性。

L-赖氨酸的生产历程从蛋白质水解法、化学合成法、酶法到当今的发酵法。对¹³C、¹⁵N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备而言，采用微生物直接发酵的生产工艺更简单成熟。近年来，L-赖氨酸的生产多采用发酵法，关于发酵法生产L-赖氨酸的研究报道很多，但是在关于用生物合成法研究¹³C，¹⁵N稳定同位素标记的L-赖氨酸盐酸盐的生产领域中还不见有专利和文献报道。采用直接发酵法制备，目标氨基酸大量富集，分离相对简单，但由于种子、发酵配方中存在有机碳、氮源，会稀释稳定同位素的丰度，如不加以工艺优化控制，常使产品的同位素丰度大为下降，以致达不到产品的质量要求。故需对工艺(主要为发酵工艺)进行优化以控制产品的丰度下降，提高稳定同位素的利用率。

发明内容

本发明的目的就是为了g服上述现有技术存在的缺陷而提供一种提高了生产效率、降低了成本的¹³C、¹⁵N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种¹³C、¹⁵N双标记-L-赖氨酸盐酸盐的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)发酵菌种的选取

选取适用于¹³C、¹⁵N双标记L-赖氨酸盐酸盐发酵生产的菌种包括短杆菌属及棒杆菌属的变异株，包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicium)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)或钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)；

(2)发酵培养基配方

发酵培养基中不添加或添加极少量的玉米浆等作为有机氮源，有机氮源的浓度为0wt％～2.0wt％，以¹³C-葡萄糖为碳源，葡萄糖总的浓度为8wt％～15wt％，以含¹⁵N的硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或尿素中的一种或几种为初始氮源，初始氮源的添加量为氮元素含量占总量的0.3wt％～1.5wt％，发酵过程中可流加含¹⁵N的尿素或氨水补充氮源，不添加或添加极少量的玉米浆、豆饼水解液、酪蛋白水解液、菌体水解液中的一种或多种作为有机氮源，该有机氮源的浓度为0wt％～2.0wt％，随菌种不同添加不同量的磷酸盐包括K₂HPO₄或KH₂PO₄，添加量为0.5g/L～4g/L；镁盐，包括MgSO₄，添加量为0.2g/L～0.8g/L；亚铁盐，包括FeSO₄·7H₂O，添加量为0.01g/L～0.06g/L及锰盐，包括MnSO₄·4H₂O，添加量为0.01g/L～0.06g/L；另外添加高丝氨酸，添加量为0.05g/L～0.30g/L；生物素，添加量为100μg/L～1000μg/L；维生素B₁，添加量为100μg/L～1000μg/L等；

(3)发酵工艺