[发明专利]用于检测猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片及检测方法

权利要求书

1.一种用于检测猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征的基因芯片，其特征在于：

采用如下表所示的探针序列：

2.如权利要求1所述基因芯片，其制备方法包括如下步骤：

根据GenBank中已发表的PCV-2、PRRSVE、PRRSVA、CSFV的序列，应用DNAStar的MEGALIGN程序找出各个病毒的保守区；寡核苷酸潜在的二聚体和特异性用NCBI即美国生物技术信息中心网站，http://www.ncbi.nlm.nih.gov的BLAST程序结合PrimerPremier5.0、Oligo6.0进行鉴定；根据探针、引物设计的相关原则及利用上述软件设计扩增目的片段的引物序列和探针序列，其序列和特性见下表1、表2；合成时在每个探针的5’加上1个氨基和15个T；正链引物用CY-3荧光标记；引物用双蒸水稀释为100μmol/L，-20℃保存备用；

在氨基化片基上点制的60-mer寡核苷酸探针，质量等级为PAGE级；寡核苷酸探针用无菌水溶解后，再与2×上样缓冲液，按1∶1混合，使点样终浓度调整为25μmol/L，通过晶芯个人点样仪将探针片段有序地点制成6行×5列的阵列，每条探针横向重复点3个点；点制好的基因芯片通过37℃水浴放置18h以上后经洗涤、封闭、干燥后置干燥器中室温保存；所述上样缓冲液为pH 7.4含0.5％SDS的200μmol/L PBS；

表1基因芯片引物序列：

表2基因芯片探针序列：

3.采用权利要求1或2所述基因芯片检测猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征的方法，包括如下步骤：

(1)标准病毒基因的扩增：

按照分子生物学实验技术提取标准猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的DNA或RNA，对RNA进行反转录后进行多重PCR体系的构建及优化，对优化好的体系进行带标记引物的PCR扩增，体系如下：

PCR体系I：包括PCV-2、PRRSVA、CSFV的三种模板DNA或者cDNA各1μL；10×PCRBuffer2.5μL；浓度25mmol/L的MgCl₂2μL；浓度为10mmol/L四种dNTPs0.8μL；Taq DNA聚合酶0.4μL；5端代CY-3标记的10μmol/L四种引物各1μL，加入无菌水至25μL体系；

PCR体系II：包括PRRSVA、PRRSVE的cDNA各1μL；10×PCR Buffer2.5μL；浓度25mmol/L的MgCl₂2μL；浓度为10mmol/L四种dNTPs0.8μL；Taq DNA聚合酶0.4μL；5端代CY-3标记的10μmol/L两种引物各1μL，加入无菌水至25μL体系；

PCR反应程序：用PCR仪在94℃温度环境下变性6min；循环步骤为94℃变性30s，54℃/58℃退火30s，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min，PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳；

(2)基因芯片杂交：

配制15μL的杂交体系：5μL的带标记的PCR产物和10μL芯片杂交液，芯片杂交液含25％甲酰胺、10×SSC、0.2％SDS，将两者混合均匀后放入PCR仪进行高温变性；变性条件为：95℃变性5min后，立即置于冰浴上快速冷却3min；将15μL杂交体系小心地加入到如权利要求2所述基因芯片的小孔里，组装上杂交盒，放入40～42℃的水浴锅进行杂交2～4h；

(3)对杂交好的芯片清洗及扫描结果分析：

对杂交好的芯片要进行洗片；将洗好的芯片置于50ml离心管中在台式冷冻离心机离心2min以甩干，再利用晶芯微阵列芯片共聚焦激光扫描仪进行扫描并对结果进行分析；

(4)对被检病毒基因的检测：

用设计的引物对被检病毒基因进行扩增、基因芯片杂交和对杂交好的芯片清洗及扫描结果分析，即将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核苷酸探针杂交，扫描、分析芯片上荧光信号；其具体操作方法同步骤(1)、(2)和(3)；并与标准病毒基因扫描结果进行比对，获得检测结果。