[发明专利]用于检测猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因技术和计算机数据分析领域，尤其涉及一种用于检测猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)、猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2，PCV-2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型与美洲型(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus Europe type and America type，PRRSE，PRRSVA)基因芯片及芯片的制备方法，以及采用该基因芯片进行检测或诊断病毒的方法。 

背景技术

随着规模化猪场的增加，猪疫病的种类也在增加，旧的疫病没有消灭，新的疫病不断出现，并且随着病毒株的变异使猪的疫病日益呈现复杂化和严重化趋势。猪瘟(ClassicalSwine Fever，CSF)、猪圆环病毒病2型(Porcine Circovirus type 2，PCV-2)和猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是目前威胁我国猪的主要传染性疾病。对于危害全球养猪业发展的猪主要疫病，快速准确诊断是控制该病重要前提。常规的病毒分离诊断方法虽然准确，但费时费力，并且需要专门的技术人员进行操作。基于分子生物学的诊断方法要以RT-PCR和荧光PCR为主。RT-PCR比荧光RT-PCR方法灵敏度低、耗时长；荧光RT-PCR方法具有高灵敏度的特点，但检测成本高，并且不能同时检测几种疾病。 

近年来，猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)、猪圆环病毒2型(PorcineCircovirus Virus type 2，PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus，PRRSV)已成为危害世界规模化养猪业的重要猪病症候群。这些病原均可导致猪的繁殖障碍，且常成混合感染，不易区分，给临床鉴别诊断造成较大困难。在这种情况下，如何快速、灵敏、准确地对多种疫病同时做出诊断以及早制定和采取相应防制措施是现代动物疫病检疫新的发展方向。基因芯片技术是近年来兴起的一种早期快速检测的方法，通过高通量平行检测病原体的多个基因，可大大提高检测的灵敏度和精确度，克服了PCR扩增以单个基因为靶标进行检测而易出现假阳性及假阴性的缺点，同时通过计算机软件分析杂交结果，降低了结果判断的主观因素，因而能够快速、准确、高通量地对多种疾病进行早期的快速诊断与排查。但是，目前未有成熟的基因芯片检测技术 应用于猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征(亚型)的检测。 

发明内容

针对现有技术存在检测费时费力和成本高，且只能对单一病种进行检测之不足，本发明的目的是提供一种猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征病毒基因芯片，以及该芯片的制备方法； 

进一步，本发明还提供采用该基因芯片对猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征三种病同时进行检测的方法。 

本发明采用的技术方案如下：一种用于检测猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征的基因芯片，其特征在于：采用如下表所示的探针序列： 

所述基因芯片的制备方法，包括如下步骤： 

根据GenBank中已发表的PCV-2、PRRSVE、PRRSVA、CSFV的序列，应用DNAStar的MEGALIGN程序找出各个病毒的保守区；寡核苷酸潜在的二聚体和特异性用NCBI即美国生物技术信息中心网站，http://www.ncbi.nlm.nih.gov的BLAST程序结合PrimerPremier5.0、Oligo6.0进行鉴定；根据探针、引物设计的相关原则及利用上述软件设计扩增目的片段的引物序列和探针序列，其序列和特性见下表1、表2；合成时在每个探针的5’加上1个氨基和15个T；正链引物用CY-3荧光标记；引物用双蒸水稀释为100μmol/L，-20℃保存备用； 

在氨基化片基上点制的60-mer寡核苷酸探针，质量等级为PAGE级；寡核苷酸探针用无菌水溶解后，再与2×上样缓冲液，按1∶1混合，使点样终浓度调整为25μmol/L，通过晶芯 个人点样仪将探针片段有序地点制成6行×5列的阵列，每条探 针横向重复点3个点；点制好的基因芯片通过37℃水浴放置18h以上后经洗涤、封闭、干燥后置干燥器中室温保存；所述上样缓冲液为pH 7.4含0.5％SDS(十二烷基磺酸钠)的200μmol/L PBS(磷酸缓冲盐溶液)；