[发明专利]酶活性及热稳定性被提高的葡聚糖酶

说明书

技术领域

本发明涉及一种葡聚糖酶，特别涉及一种β-1，3-1，4-葡聚糖酶。

背景技术

β-葡聚糖(β-Glucan)普遍存在于麦类(如大麦、小麦、燕麦)和谷类植物胚芽细胞壁中，β-葡聚糖是一种黏性物质，由约1200个β-D-葡萄糖基以不同的比例的β-1，3和β-1，4糖苷键连接而形成的长链多糖体。β-葡聚糖通过氢键紧密排列，形成不可溶的多糖体，如果要将自然界广泛存在的β-葡聚糖转变为可利用的能量，则必需依赖β-葡聚糖酶。β-1，3-1，4-葡聚糖酶(β-1，3-1，4-Glucanase)为半纤维素水解酶，可专一地水解邻近β-1，3键的β-1，4糖苷键，主要产物为纤维三糖及纤维四糖。目前已发现多种微生物能分泌β-1，3-1，4-葡聚糖酶，如芽孢杆菌、瘤胃真菌、嗜热厌氧纤维水解菌等。

β-葡聚糖酶在工业上的应用十分广泛，如啤酒酿造、动物饲料添加及食品加工等。举例来说，在啤酒酿造加入β-葡聚糖酶可以降低麦汁粘度、改善麦汁混浊度，并提高啤酒过滤速度及增加批次滤酒量。在动物饲料中添加β-葡聚糖酶可以帮助动物分解麦类的成份(大麦、小麦及燕麦)，增加饲料中营养物质的利用率，促进动物的消化吸收和生长发育，进而解决单胃家禽动物因肠胃道寄生细菌缺乏可分解此类多醣聚合物的β-葡聚糖酶，而造成的吸收困难与消化排泄问题。然而针对不同工业的应用，葡聚糖酶也需有符合其不同的适用条件与范围，例如高耐热性、高活性及耐酸碱性等，如此在工业应用上才更有其商业价值及竞争性。因此，找出符合不同工业上所需的酶蛋白也是目前学术及产业界持续努力的目标。

在许多相关的研究中，为了得到更佳的酶，除了从自然界中筛选合适的酶基因之外，另一个途径就是将现有产业化的酶蛋白再加以进行基因改造，以符合不同产业的需要。现今改造酶蛋白主要有两大策略，其一是随机突变或是将酶基因随机排列，再在特定的作用条件下，筛选出更符合其作用条件的酶蛋白。此策略的好处是无须深入研究酶的结构或作用机制，而是直接在特定的条件下随机去找出更好的酶蛋白，但其缺点是需要大量的人力以及时间去进行大量的筛选，并且此方法也需要有很好的大量筛选方法来配合。另一种改造策略则是通过研究酶的三维结构与作用机制以找出对于酶活性或特性具有关键性的氨基酸，并针对这些特定氨基酸进行定点突变并测试，进而得到功能性更强的改造酶蛋白。此策略的优点是不需花费时间与人力在大量的蛋白突变与筛选的步骤，但需要先了解此酶的蛋白结构以及其作用机制，如此才能找出具有改造潜力的特定氨基酸。

因此，本发明通过改造基因而改良葡聚糖酶的活性及热稳定性，并相对地降低制造成本，进而有效地提高葡聚糖酶在工业上的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于改造现有的葡聚糖酶，利用结构分析及点突变技术，有效地提高葡聚糖酶的作用活性及热稳定性而增加葡聚糖酶的产业价值，并且大幅降低成本。

为达上述目的，本发明的一个较广义实施方式是提供一种葡聚糖酶，其包含将序列号2的第18位置的缬氨酸(Valine)突变为酪氨酸(Tyrosine)及第203位置的色氨酸(Tryptophan)突变为酪氨酸(Tyrosine)的氨基酸序列。其中，编码所述的序列号2所表示的氨基酸序列的基因是筛选自沙斯诺金纤维分解菌(Fibrobacter succinogenes)的Fsβ-葡聚糖酶基因，所述的葡聚糖酶为β-1，3-1，4-葡聚糖酶，且所述的葡聚糖酶具有序列号8的氨基酸序列。

为达上述目的，本发明的另一个较广义实施方式是提供一种葡聚糖酶，其包含将序列号2第203位置的色氨酸(Tryptophan)突变为酪氨酸(Tyrosine)的氨基酸序列。其中，编码所述的序列号2所表示的氨基酸序列的基因系筛选自沙斯诺金纤维分解菌(Fibrobacter succinogenes)的Fsβ-葡聚糖酶基因，该葡聚糖酶为β-1，3-1，4-葡聚糖酶，且所述的葡聚糖酶具有序列号6的氨基酸序列。

为达上述目的，本发明的另一个实施方式是提供一种葡聚糖酶，其包含将序列号2第18位置的缬氨酸(Valine)突变为酪氨酸(Tyrosine)的氨基酸序列。其中，编码所述的序列号2所表示的氨基酸序列的基因是筛选自沙斯诺金纤维分解菌(Fibrobacter succinogenes)的Fsβ-葡聚糖酶基因，所述的葡聚糖酶为β-1，3-1，4-葡聚糖酶，且所述的葡聚糖酶具有序列号4的氨基酸序列。

附图说明

图1为编码野生型Fsβ-葡聚糖酶的全长的核苷酸及由此推导的氨基酸序列。