[发明专利]一种谷氨酸脱氢酶的突变体酶及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用突变体酶及其构建方法，特别属于谷氨酸脱氢酶的突变体酶及其构建方法。

背景技术

氨基酸脱氢酶家族(amino acid dehydrogenases，EC 1.4.1)，该家族蛋白利用NAD⁺或者NADP⁺为辅因子催化氨基酸氧化脱氨形成相应的酮酸。反应如下所示：

该家族包括谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase，GDH)、亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase)、缬氨酸脱氢酶(Valine dehydrogenase)和苯基丙氨酸脱氢酶(Phenylalanine dehydrogenase)。由于这些氨基酸脱氢酶能够催化特异性的反应，它们经常被用于饮食及药物氨基酸的合成，还能用于氨基酸和氨的临床检测。该家族的一些成员共享序列结构类似但是在底物特异性、稳定性和耐盐性等方面不同。

谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase，GDH)能以NAD(P)⁺为辅酶催化谷氨酸氧化脱氨和还原氨的可逆反应。广泛存在于细菌、动物及植物等生物体内，是连接碳、氮代谢的重要酶类，对于细胞内环境氧化还原性的平衡以及生物代谢等生命活动具有重要意义。谷氨酸脱氢酶是谷氨酸生产菌合成谷氨酸代谢过程中的关键酶，还能用于酶电极制作，医疗诊断如医药工业中医用试剂尿素氮试剂盒的制备等，GDH测定还可作为常规肝功能检测项目，特别适用于慢性肝病患者肝脏损伤程度判断、疗效观察和病情监测。除此之外它还是疟疾快速诊断的新型候选分子。但上述酶只能催化谷氨酸，不能催化其它的氨基酸，用途受到了一定的限制。

发明内容

本发明所要解决的第1个技术问题是提供一种可以催化多种氨基酸的谷氨酸脱氢酶的突变体酶。

本发明所要解决的第2个技术问题是上述突变体酶的构建方法。

本发明从鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)中获得谷氨酸脱氢酶基因，通过突变引物获得了突变的基因片段，其编码如序列表所示的氨基酸序列，将突变基因片段与pET28b质粒连接，成功构建重组表达质粒pET28b-KA/LG；该重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，构建用于突变体酶表达的基因工程菌Rosetta(DE3)/pET28b-KA/LG；在常温37℃和0.5mM IPTG条件下获得了较好的表达。

本发明与现有技术相比，所生成的工程菌不仅能催化谷氨酸，而且还能催化甲硫氨酸和正亮氨酸。

附图说明

图1为gdh基因的PCR扩增图。

M：Marker III；1：gdh基因的PCR扩增产物

图2为A166G片段PCR扩增图

M：Marker III；1：A166G下游片段；2：A166G上游片段

图3为A166G融合PCR扩增图

M：Marker III；1：A166G融合PCR产物

图4为KA/LG片段PCR扩增图

M：Marker III；1：KA/LG下游片段；2：KA/LG上游片段

图5为KA/LG融合PCR扩增图

M：Marker III；1：KA/LG融合PCR产物

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

实施例1：

1、谷氨酸脱氢酶基因gdh获得

依据鼠伤寒沙门氏菌atcc 14028(Salmonella typhimurium)已知的谷氨酸脱氢酶基因设计引物，以S.typhimurium基因组DNA为模板，PCR扩增，结果仅获得1个特异片段(图1)。gdh扩增引物及PCR条件分别为：

Sense：5′-GAACCACGTCATATGGATCAGACATGTTC-3′；

Anti-sense：5′-ATCCCTCGAGAAAGCTATCTGGCCTGAC-3′；

95℃预变性3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min 30s循环35次；72℃充分延伸10min。

2、重组载体pET28b-gdh构建

扩增的产物与载体pET28b分别经NdeI、Xho I双酶切后，连接，转化E.coliDH5α。筛选阳性克隆，获得表达质粒pET28b-gdh。双酶切鉴定后，送南京金丝瑞进行测序，序列比对发现测序基因与Genbank(GeneBank accession NO.NP_460265)上的完全一致。

3、突变体菌株的构建