[发明专利]制备蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备蛋白质及蛋白质的方法，更具体地涉及肽的连接方法。

背景技术

蛋白质的结构和功能关系是当前生物学的前沿热点问题之一，而高纯度的或者特定非天然修饰的蛋白质的获得能大大促进该领域的发展。蛋白质的化学合成与半合成是被认为是获得具有特定结构修饰的目标蛋白的重要途径，因此发展高效的合成技术是极具学术和商业价值的。早在1901年，有机合成大师Fisher就提出化学合成生物酶的构想。1963年，Merrifield发展固相合成多肽技术将化学合成生物活性肽变成现实。然而，由于长链多肽在树脂上聚集十分严重，固相合成多肽被认为只能实现50个以下氨基酸残基的高效合成。基于这一问题，芝加哥大学Kent发展出自然化学连接策略。此法可以将两段及其以上的肽片段高效连接从而实现100个以上残基氨基酸的合成。目前，自然化学连接被认为是应用最为广泛的和最为高效的蛋白质合成方法。Kent等人利用其发展的“自然化学连接”成功合成出一系列具有天然功能的蛋白质分子，如牛胰岛素抑制剂、人体分泌活性II型磷脂酶、S型抗凝血微蛋白质、细胞色素、含8个单糖基的淋巴毒素蛋白、均一高分子修饰的人造红血球生成蛋白、HIV-1蛋白酶、人体溶菌酶、共价二聚体HIV-1蛋白酶、抗冻蛋白、类胰岛素生长因子等。

如图1所示，自然化学连接法的基本策略：在中性的水溶液中，肽1的硫酯化物与N-端半胱氨酸的肽2可以发生高效的化学选择性的连接反应。然而，自然化学连接技术需要制备多肽的硫酯化物。多肽的硫酯化物需要采用Boc-SPPS方法进行合成，但是Boc-SPPS需要使用高腐蚀性的HF。此外，糖基化、磷酸化及硫酸化的多肽对HF不稳定，不能高效合成。因而，目前的蛋白质的合成方法有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种蛋白质的合成方法，能够有效地进行肽连接。

在本发明的一个方面，根据本发明实施例，提供了一种制备蛋白质的方法，其包括通过下列步骤将C端具有酰肼基团的第一肽与N端为半胱氨酸的第二肽连接：将所述第一肽与所述第二肽在含有NaNO₂的溶液中混合并调节pH至酸性pH，以便将所述第一肽的酰肼基团转化为酰基叠氮基团得到第一反应混合物；向所述第一反应混合物中添加含有还原剂的溶液并调节pH至中性pH，其中所述还原剂含有巯基基团，以便所述第一肽的酰基叠氮基团转化为硫酯基团，维持所述中性pH进而所述第一肽的C端硫酯与所述第二肽的N端发生连接反应形成蛋白质。

根据本发明的特征，制备蛋白质的方法还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的一个实施例，所述还原剂为4-巯基苯基乙酸。

根据本发明的一个实施例，所述C端具有酰肼基团的第一肽是通过包括下列步骤的方法合成的：表达含有内含子的蛋白质与C端没有酰肼基团的第一肽的融合蛋白；以及对所述融合蛋白进行肼解，获得所述C端具有酰肼基团的第一肽。

根据本发明的一个实施例，所述酸性pH为3.0-4.0。

根据本发明的一个实施例，利用氢氧化钠调节pH至所述中性pH。

在本发明的另一个方面，根据本发明的实施例，还提供了一种制备多肽硫酯化物的方法，其特征在于包括以下步骤：将作为原料的第一肽与含有NaNO₂的溶液混合，并调节pH至酸性pH，以便将所述第一肽的酰肼基团转化为酰基叠氮基团得到第一制备反应混合物；向所述第一制备反应混合物中添加含有还原剂的溶液，并调节pH至中性pH，其中所述还原剂含有巯基基团，以便所述第一肽的酰基叠氮基团转化为硫酯基团，形成多肽硫酯化物。

根据本发明的实施例，制备多肽硫酯化物的方法还可以具有其他附加技术特征：

根据本发明的一个实施例，所述酸性pH为3.0-4.0。

根据本发明的一个实施例，所述还原剂为4-巯基苯基乙酸。

根据本发明的一个实施例，所述C端具有酰肼基团的第一肽是通过包括下列步骤的方法合成的：表达含有内含子的蛋白质与C端没有酰肼基团的第一肽的融合蛋白；以及对所述融合蛋白进行肼解，获得所述C端具有酰肼基团的第一肽。

根据本发明的一个实施例，利用氢氧化钠调节pH至所述中性pH。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：