[发明专利]检测单细胞特异性抗体分泌的细胞微孔芯片及其制备方法

说明书

技术领域

本发明建立了一种可以在单细胞水平上高通量检测表达或分泌特异性标志分子的细胞的微孔芯片。这一芯片适合鉴定、分析B细胞(来源于人或其他脊椎动物)、杂交瘤细胞(鼠源或人源)或分泌抗体的工程细胞等在单细胞水平上特异性抗体的分泌情况，另外还可用于检测癌细胞表面标志分子以及评价药物筛选中药物对细胞功能的影响等，制备方便，价格经济，操作简单。

背景技术

微阵列芯片(Microarray Chip)研究起始于20世纪80年代末，是指以高密度阵列为特征，将核酸探针、蛋白质探针等以极高的密度固定在经过微细加工的固相表面上，通过荧光以进行高通量的筛选研究[1]。根据所阵列探针种类的不同，微阵列芯片可分为基因芯片、蛋白质芯片以及细胞芯片等。基因芯片和蛋白质芯片目前已经被广泛应用于基因表达差异研究、遗传学研究、蛋白质组学研究等生命科学的研究中[2]。

细胞芯片技术是以活细胞作为研究对象的一种生物芯片技术，其既保持传统的细胞研究方法的优点如原位检测等，又满足了高通量获取活细胞信息等方面的要求[3]。细胞芯片技术可以高通量分析细胞的多种生理现象及分子机制，具有传统方法不可比拟的优势。目前的细胞芯片技术一般指运用物理学、化学原理在芯片上完成对特异性细胞的捕获、固定、培养等精确操作，并通过对不同信号的分析实现对细胞特定生理指标的检测和性质分析。细胞免疫芯片是细胞芯片的重要种类，其原理主要基于抗原或抗体的固相化、抗原抗体特异性反应及抗原或抗体的检测方法(如荧光标记、酶标记及放射标记等)，以实现对特定细胞标志分子的精确检测，细胞免疫芯片具有特异性好、通量高、操作方便等优点，已经被广泛应用于新药筛选、免疫诊断、肿瘤靶标抗原分析等研究领域[3]。

目前的细胞免疫芯片主要的设计思路为以玻片为基底，通过不同方法活化并标记上抗体或抗原，形成蛋白微阵列芯片，然后将细胞悬液和微阵列孵育并洗去非特异性结合的细胞，再通过不同的标记方法检测特异性结合在芯片上的细胞。其实质还是固相蛋白芯片的设计思路和原理，只不过将待测样品中的研究对象换为了细胞。这一设计无法实现细胞的精确控制，不能在单细胞水平上检测细胞某特定生理指标(如抗体分泌)的情况。此外，目前被广泛使用的另一种重要的细胞分析方法流式细胞技术(FACS)，虽然可以分析出某细胞群落中特定细胞所占的比例，但是也无法在单细胞水平上高通量的实现对某个细胞特定指标的原位观察和分析。

在抗体工程的相关研究中，在单细胞水平上，尤其是在活体细胞中检测其分泌特异性抗体的情况是十分需要的。对于一群细胞，如杂交瘤细胞、抗体工程细胞等，如何高通量地在其中寻找到分泌抗体亲和力最高、分泌量最大的细胞，对于后续的杂交瘤克隆筛选或者工程抗体高表达细胞株的构建等都具有极其重要的意义。另外，单细胞水平上特异性抗体的检测对于研究B细胞群落中特定抗体分泌细胞的具体情况，对于某些天然存在的极少量的有特殊价值的B细胞(如分泌针对某些独特表位抗体的B细胞)的筛选和获得等也是十分需要的。

目前，国际上已经有几种可以在单细胞水平上高通量分析细胞某特定生物学指标变化的细胞微孔芯片出现。如Biran等制作了通过光成像技术在单细胞水平上检测细胞某生理指标变化(如基因表达差异)的细胞微孔芯片[4]，Deutsch等也研发了类似的单细胞高通量检测芯片[5]。但是，检测细胞分泌抗体情况的细胞微孔芯片产品国际上目前研究的还比较少。日本富山大学科研人员研制的抗体检测微孔芯片，采用微机电系统加工制作，首先用热氧化技术在硅片表面生长出一层二氧化硅薄膜，将利用光刻技术制作的微孔模型覆盖于二氧化硅薄膜表面，利用氢氟酸溶剂处理制备微孔芯片，并在其表面加工出氟碳聚合物。其芯片孔径适合容纳单一B细胞，并且通量达到234000孔/片。该芯片通过检测抗原刺激后，细胞内Ca²⁺变化情况或者直接荧光标记待测抗原并与细胞表面受体结合从而确定针对某抗原抗体的分泌细胞[6，7]。通过显微操作技术可以获取目的细胞并进行PCR，获得特异性抗体基因。

发明内容

本发明首次使用光刻技术制备细胞微孔芯片模板，然后灌注聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料，制成细胞培养阵列芯片，实现每个细胞单独处于一个阵列小室并进行培养。生物相容性材料PDMS作为细胞微孔芯片的制备材料，同硅片材料比较，其优点是生物相容性好，无毒，透气性佳，适合细胞生存，容易被锻造成任何形状，且制备方便，价格经济，操作简单。