[发明专利]一种删除转基因杨树选择标记基因的方法

权利要求书

1.一种删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）采用感受态热激法将pX6-GFP质粒转入农杆菌EHA105，菌液涂抹在含有抗生素的YEB平板上，28℃培养24~36h，得转化后的单菌落，备用；

（2）将转基因杨树试管苗置于培养基M上以根部萌蘖芽方式继代繁殖1个月，备用；其中，培养基M的配方为在基本培养基MS中添加：蔗糖25~30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8；

（3）在步骤（2）培养的试管苗上选取幼嫩、平展的叶，剪去叶边缘，得叶盘为外植体，接种于叶盘分化培养基T上，控温25±2℃，光照3000~4000lux，光照时间16~18h/d，培养2~3d；

（4）在农杆菌液体培养基中扩大培养步骤（1）的单菌落，得指数生长期的菌体，在基本培养基MS液体培养基悬浮菌体，得OD₆₀₀值为0.3~0.4的侵染菌液；

（5）将步骤（3）的培养后的外植体浸入步骤（4）的侵染菌液，振荡，浸泡10~15min，除去多余菌液，转至含有50~100μmol/L乙酰丁香酮的叶盘分化培养基T上暗培养2~3d，期间多次洗除菌液；

（6）先将步骤（5）暗培养后的叶盘转移到叶盘分化筛选培养基W上培养，直至分化出不定芽；再将不定芽连同外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基Y继代培养；待不定芽伸长至1.5~2cm长，将每个不定芽分离独立移入生根筛选培养基G，直至形成完整植体；

（7）剪取步骤（6）中完整植株的茎段，依次在删除选择标记分化培养基W’、删除选择标记不定芽伸长培养基Y’、删除选择标记生根培养基G’中培养诱导愈伤组织至植株再生；利用培养基中添加的β-雌二醇，通过诱导步骤（8）获得的转基因植株茎段形成愈伤至植株再生过程删除选择标记基因；

（8）对步骤（7）的转基因植株进行PCR分子检测和卡那霉素敏感性试验检测。

2.根据权利要求1所述的根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述叶盘分化培养基T配方为在基本培养基MS中附加：蔗糖25~30g/L，琼脂6~7g/L，TDZ0.002~0.003mg/L，BA0.5~0.6mg/L，琼脂6~7g/L。

3.根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述的叶盘分化筛选培养基W配方为：MS，TDZ0.002~0.003mg/L，BA0.5~0.6mg/L，卡那霉素20mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

4.根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述的不定芽伸长筛选培养基Y配方为：MS，TDZ0.001~0.002mg/L，BA0.2~0.3mg/L，卡那霉素20mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

5.根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述的生根筛选培养基G配方为：MS，IAA0.1~0.2mg/L，卡那霉素10mg/L，蔗糖20g/L，琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

6.根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（7）中，所述删除选择标记分化培养基W’配方为：在基本培养基MS中添加：TDZ 0.002~0.003mg/L、BA 0.5~0.6mg/L、5μM β-雌二醇、蔗糖 30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

7.根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（7）中，所述删除选择标记不定芽伸长培养基Y’配方为：在基本培养基MS中添加：TDZ 0.001~0.002mg/L、BA 0.2~0.3mg/L、5μM β-雌二醇、蔗糖30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

8.根据权利要求1所述的删除转基因杨树选择标记基因的方法，其特征在于：步骤（7）中，所述删除选择标记生根培养基G’的配方为：在1/2基本培养基MS中添加：IAA 0.1~0.2mg/L、5μM β-雌二醇、蔗糖20g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6-5.8。