[发明专利]一种删除转基因杨树选择标记基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种删除转基因杨树选择标记基因的方法。

背景技术

杨树是世界上重要的造林树种之一，在我国人工林中杨树也有较大比重。在林木植物中杨树是较早开展转基因研究的树种之一，据报道通过基因工程技术已成功转入了抗病虫、耐盐碱、抗大气污染、降低木质素含量、增加生长量等基因，为培育具有优良性状的转基因杨树新品种提供了基础。但由于转基因植物的安全性等问题限制了转基因杨树的环境释放和推广应用。

近年来，转基因植物的安全性受到广泛关注，而转基因技术中标记基因的安全性问题已成为当今基因工程研究的热点。筛选标记基因作为标记基因的一种，是指在遗传转化中能够使转化细胞（或个体）从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基因；目前常用的筛选标记基因主要有两大类，即抗生素抗性酶基因和除草剂抗性酶基因；这两类标记基因在完成筛选后并不参与植物的性状改良，它在植物中的存在便是多余的，且可能对环境或非靶标生物存在潜在风险，如转基因植物的抗生素抗性标记基因可能会转移进入人或动物的病原菌中，从而引起这些病原菌对抗生素的抗性，使抗生素失去效力；标记基因也可能会转移到杂草产生所谓“超级杂草”，破坏生态安全。如何消除选择标记，培育无选择标记的转基因植物已成为基因工程研究的热点。

王永刚（2007）在“无选择标记遗传转化体系研究”（南京林业大学硕士学位论文）一文中虽利用Cre/lox系统进行杨树无选择标记遗传转化体系研究，但未获得删除选择标记基因的转基因杨树；府健（2007）在《南林895杨无选择标记遗传转化的研究》（南京林业大学硕士学位论文）也利用该系统进行无选择标记转基因杨树的研究，但在21株转基因杨树中仅检测出一株删除了选择标记基因，仅约为5%，删除效率较低。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种删除转基因杨树选择标记基因的方法，利用Cre/lox系统具有的重组删除功能，建立无选择标记基因的杨树转基因体系，为培育具生物安全的转基因杨树新品种提供一个新途径，为安全、高效的林木转基因育种提供基础。

发明内容：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种删除转基因杨树选择标记基因的方法，包括以下步骤：

（1）采用感受态热激法将pX6-GFP质粒转入农杆菌EHA105，菌液涂抹在含有抗生素的YEB平板上，28℃培养24~36h，得转化后的单菌落，备用；

（2）将经分析鉴定的转基因杨树试管苗置于培养基M上，以根部萌蘖芽方式继代繁殖1个月，备用；培养基M的配方为在基本培养基MS中添加蔗糖25~30g/L和琼脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

（3）在步骤（2）培养的试管苗上选取幼嫩、平展的叶，剪去叶边缘，得叶盘为外植体，接种于叶盘分化培养基T上，控温25±2℃，光照3000~4000lux，光照时间16~18h/d，培养2~3d；

（4）在农杆菌液体培养基中扩大培养步骤（1）的单菌落，得指数生长期的菌体，在基本培养基MS液体培养基悬浮菌体，得OD₆₀₀值为0.3~0.4的侵染菌液；

（5）将步骤（3）的培养后的外植体浸入步骤（4）的侵染菌液，振荡，浸泡10~15min，除去多余菌液，转至含有50~100μmol/L乙酰丁香酮的叶盘分化培养基T上暗培养2~3d，期间多次洗除菌液；

（6）先将步骤（5）暗培养后的叶盘转移到叶盘分化筛选培养基W上培养，直至分化出不定芽；再将不定芽连同外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基Y继代培养；待不定芽伸长至1.5~2cm长，将每个不定芽分离独立移入生根筛选培养基G，直至形成完整植株，对转基因植株进行分析鉴定；