[发明专利]一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产鸟嘌呤核苷产率的方法

说明书

(一)技术领域

本发明属于一种食品和医疗产品重要的中间体鸟嘌呤核苷的生产方法。

(二)背景技术

鸟嘌呤核苷(商品名称：GR)又名9-β-D-呋喃核糖基鸟嘌呤，简称鸟嘌呤核苷，英文名称Guanosine。鸟嘌呤核苷为白色结晶性粉末或类白色结晶性粉末，溶于水、嘧啶，不溶于醇。分子式为C₁₀H₁₃H₅O₅，相对分子量为283.24。化学结构式如下：

鸟嘌呤核苷的用途十分广泛，是食品和医药产品的重要中间体。在医药工业领域，鸟嘌呤核苷主要是作为合成利巴韦林、阿昔洛韦等核苷类抗病毒药物的重要中间体，也是用于制造无环鸟嘌呤核苷(Acyclovir)、三氮唑核苷(ATC)、三磷酸鸟嘌呤核苷钠(GTP)、抗癌药物氟铁龙(5-氟脱氧尿苷)等药物的主要原料；在食品工业领域，鸟嘌呤核苷是作为呈味核苷酸鸟嘌呤核苷酸二钠的主要原料，与肌苷酸二钠混合简称I+G，添加到味精中即是第二代、第三代味精，具有十分广阔的市场。目前，鸟嘌呤核苷需求量以每年10％-20％的速度增加。

鸟嘌呤核苷的生产方法有化学合成法、菌体自溶法、发酵法。由于化学合成法需要大量有机溶剂，存在原料来源及环境污染等问题在生产中极少使用；菌体自溶法由于其效率太低目前也基本不用；发酵法生产鸟嘌呤核苷由于其产率高、周期短、控制容易等优点，目前已经成为工业化生产鸟嘌呤核苷的重要方法。以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为发酵菌种制备核苷具有产量高、产物中副产物少、便于产物分离提取等优点，因而，枯草芽孢杆菌成为核苷发酵工业最重要的生产菌。20世纪60年代日本就大规模开展了发酵法生产鸟嘌呤核苷研究，主要侧重于传统的诱变育种技术改变菌种特性，提高鸟嘌呤核苷产量，最高达20g/L，而且近几年对鸟嘌呤核苷发酵研究较少。而我国对鸟嘌呤系列的化合物的研究始于80年代，随着鸟嘌呤核苷市场需求激增，越来越多的科研机构对鸟嘌呤核苷发酵进行了全面深入的研究。据调查显示，目前国内鸟嘌呤核苷发酵水平与世界先进水平有很大差距。主要原因是育种技术落后，菌种产苷水平不高；发酵周期长、转化率及提取综合收率低。因此，开发高产鸟嘌呤核苷工程菌和高效生产工艺是十分必要的。

(三)发明内容

针对上述同类技术的不足，本发明的目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产鸟嘌呤核苷产率的方法。

本发明的具体生产方法是如下所述：

(1)摇瓶液体菌种培养

①选用枯草芽孢菌GDGR-1006为保藏菌种；

②将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、苹果酸、酵母粉、琼脂、水按比例配制成初级菌种培养基装入茄瓶；

③在步骤②所述的初级菌种培养基中接入保藏菌种，接种量为0.1％±0.02％，在温度37℃±0.5℃条件下，静置培养22h±2h后获得初级菌种；

④将所述的初级菌种放入摇瓶培养基中，接种量为0.1％±0.02％，在往复式摇床上培养，转速160±10转/分，温度37℃±0.5℃，时间周期12-14h，当菌种镜检及OD等各项指标达标后即获摇瓶液体菌种。

(2)高产率鸟苷发酵液制取

①将葡萄糖液、磷酸氢二钾、硫酸镁、苹果酸、酵母粉、水按比例配制成二级菌种培养基，经121℃±1℃、15min±1min的蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，降温至37℃±0.5℃后，接入步骤(1)④所述的摇瓶菌种，接种量为0.1％±0.02％，同时将经过0.25～0.3Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐，此时通风比1∶0.2～0.4v/V.min，pH6～8，压力0.03～0.1MPa，培养10h～12h，经菌种镜检及OD等各项指标达标后即获得二级菌种；

②将葡萄糖液、磷酸氢二钾、硫酸镁、苹果酸、酵母粉、水按比例配制成发酵培养基，经121℃±1℃、15min±1min蒸汽灭菌后泵入发酵罐，降温至37℃±0.5℃后接入二级菌种，接种量为10％；同时按照上述步骤(2)①中保压无菌空气输入的条件下，将经120℃±1℃、8min±1min蒸汽灭菌后的葡萄糖液与苹果酸同时进行连续流加；此时通风比为1∶0.3～0.6v/V.min，pH 6～8，压力0.04MPa～0.1MPa，发酵50h～60h；当产苷达到45g/L±2g/L、转化率28％±2％时，即获得鸟嘌呤核苷发酵液。