[发明专利]一种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的细胞内过氧化氢的检测方法

权利要求书

1.一种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的细胞内H₂O₂的检测方法，包括以下步骤：

1）制备辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料：将纯化的凹土超声分散，控制分散液的pH值使其表面带负电荷，将凹土分散液与辣根过氧化物酶混合，表面带正电荷的辣根过氧化物酶分子吸附到凹土表面，形成辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料；

2）制备生物传感器：将步骤1）制得的纳米复合材料分散成均相溶液，利用滴涂法修饰到玻碳电极表面，制备成辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料生物传感器；

3）以所述的传感器为工作电极，使用计时电流法检测细胞中H₂O₂。

2.根据权利要求1所述的细胞内H₂O₂的检测方法，其特征在于所述的步骤1）中，辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料按以下方法制备：

1）将提纯过后的凹土加入到0.1 mol/L PBS溶液中，控制pH值范围在7–7.5间, 超声分散0.5–2小时，得到0.5–5 mg/mL的凹土分散液；

2）将凹土分散液与pH值 7–7.5的1–10 mg/mL辣根过氧化物酶PBS 溶液混合，在4 °C连续搅拌0.5–2小时，通过正负电荷的静电吸引作用，辣根过氧化物酶吸附到凹土表面，形成辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的悬浊液；

3）将辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料悬浊液离心处理15-30 分钟，并用去离子水洗涤，除去表面松散的酶分子，在真空干燥器中晾干，得到辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料。

3.根据权利要求1所述的细胞内H₂O₂的检测方法，其特征在于所述的步骤2）中，辣根过氧化物酶-凹土复合材料生物传感器的制备方法是：将玻碳电极抛光至镜面，在超纯水中超声清洗后晾干；将所述的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料加入 0.1 mol/L pH值 7–7.5的PBS溶液中，得到1 mg /mL均相分散液，将2–10 μL的该分散液滴加到玻碳电极表面，待溶剂挥发后即得到基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料生物传感器。

4.根据权利要求1所述的细胞内H₂O₂的检测方法，其特征在于所述的步骤3）中，首先建立辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料生物传感器检测H₂O₂浓度的工作曲线；再利用计时电流法采集样品的I-t数据，根据建立的工作曲线，得到细胞中H₂O₂含量。

5.根据权利要求5所述的细胞内H₂O₂的检测方法，其特征在于所述计时电流法的工作电位为–400 mV。