[发明专利]一种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的细胞内过氧化氢的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于酶传感的细胞内过氧化氢的电化学检测方法，特别是涉及一种基于辣根过氧化物酶–凹土纳米复合材料的细胞内过氧化氢的检测方法，属于生物传感和细胞电化学技术领域。

背景技术

细胞在代谢过程中不断产生各种活性氧（reactive oxygen species，ROS），例如超氧阴离子自由基(O₂^-·)、羟自由基(·OH)、脂自由基(ROO·)、过氧化氢(H₂O₂)等。过氧化氢是其中最为稳定的一种，并且其浓度和O₂^-·、·OH等其他ROS分子密切相关，最新的研究发现过氧化氢在生命体系的细胞代谢过程中扮演着重要的调节作用。过氧化氢可作为信号分子或第二信使参与多种因子细胞生物学效应的启动，但同时也可与细胞内的生物大分子反应，从而直接引起细胞膜脂质过氧化、细胞内蛋白质和酶类变性、核酸DNA 损伤等，最终导致细胞死亡、组织损伤、心血管疾病、肿瘤及神经元退变等多种疾病的发生。因此，发展一种可靠的、灵敏的检测细胞中过氧化氢的方法在生理学和病理生理学领域有着极其重要的意义。

目前检测过氧化氢的方法主要有荧光法、化学发光法、高效液相色谱法、电子顺磁共振法和基于酶传感的电化学方法等。然而，细胞水平的H₂O₂检测仍然受到较多因素制约，如细胞尺度小、胞内超氧自由基的半衰期非常短、稳态浓度极低以及缺少对H₂O₂有效捕获的探针等，而且一些传统的分析方法存在取样体积大、质量检测限高、分析时间长、仪器价格昂贵等不足。在众多的检测方法中，基于酶传感的电化学方法由于其具有灵敏度高、响应快、样品消耗量小、专一性强、易于制备和小型化等优点而倍受人们关注。

基于酶传感的电化学方法是将具有氧化还原特性的蛋白质（酶）固载到某种材料上并将其修饰到电极表面构建成电化学传感器，通过蛋白质（酶）的电催化性能对底物过氧化氢进行检测。辣根过氧化物酶由于其结构已知、来源广泛而成为研究催化H₂O₂氧化还原反应的重要模型酶分子之一。然而，目前所选用的蛋白质载体大都为各类碳材料（如石墨、碳纳米管、碳纳米纤维、有序碳介孔材料以及石墨烯等）、金属氧化物（多孔氧化铝、氧化锆、四氧化三铁等）、高分子（如壳聚糖、海藻酸钠、淀粉、聚苯乙烯、聚乙烯及甲基丙烯酸甲酯MMA）等。这些固定载体都存在一些不足之处，如虽然碳材料具有良好的导电性能、较强的吸附能力等优点，但其是否对生物大分子会产生毒害作用从而影响到生物大分子的生物活性目前仍不是太清楚; 而金属氧化物虽具有稳定性好、机械强度高、成本低等优点，但是生物大分子在其表面已失去原有构象，产生变性，导致固定在其表面的蛋白质（酶）失去生物活性；天然高分子载体最大的特点是无毒性作用，但是它们存在强度较低、导电性能差、在厌氧条件下易被微生物分解及使用寿命低等缺点；合成的有机高分子材料由于其化学、物理性能都有很大的可变性，理论上可以担当任何一种酶的载体，而且比天然高分子化合物的强度高，但是却存在导电性能差的缺点，这是电化学研究的最大不利因素之一。

凹土（全称凹凸棒石粘土）是一种纳米尺寸的天然化合物，具有表面吸附效应、浓集效应、吸附定向效应和化学活泼性效应等；凹土表面含有大量能和蛋白质（酶）反应的–OH基团，可以大大提高和蛋白质（酶）之间的结合力；由于凹土的 “沸石型的孔道”结构，凹土具有大的比表面积和多孔结构，易于和蛋白质（酶）交联提高固定的稳定性；凹土具有良好的生物相容性与电化学稳定性、良好的机械强度、热稳定性、耐生物降解性以及对蛋白质（酶）的高度亲和性等特性，这些都是凹土作为蛋白质（酶）的载体并研究它们的电化学特性的有利条件。

以凹土为载体固定辣根过氧化物酶制备辣根过氧化物酶-凹土复合纳米材料，能保持辣根过氧化物酶的天然结构和生物活性，将所得到的纳米复合材料修饰到玻碳电极表面得到生物传感器，对过氧化氢有良好的电催化活性；本发明建立了一种基于辣根过氧化物酶–凹土复合材料的检测细胞内H₂O₂的新方法，在生物电分析化学、细胞学和生理病理学等领域有着重大意义。

发明内容