[发明专利]利用人工合成的抗菌肽基因培育抗萎病棉花的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及利用一种人工合成的抗菌肽基因培育抗黄萎病棉花的方法。

技术背景

棉花不仅是世界上最重要的天然纤维作物，也是我国关系国计民生的重要物资，棉花产业对我国纺织工业乃至整个国民经济发展都具有举足轻重的作用。但是，棉花黄萎病自1935 年传入我国以来，对我国棉花生产的危害逐年加重。黄萎病已成为当前棉花实现高产、稳产的主要限制因素。该病属土传维管束病害，其特点是分布广、危害重、寄主范围广、传播途径多、病原菌存活时间久，是棉花生产中最具毁灭性的病害之一。更重要的是我国主栽的陆地棉品种缺乏高抗黄萎病的种质资源，生产上一直没有找到能根治的措施，因此，黄萎病被称为棉花生产的“癌症”。生产实践证明，选育和推广抗病品种，是防治黄萎病最经济有效，而且是唯一有效的途径（顾本康等，1996）。

历经几十年的努力，利用常规育种手段，我国获得了一些对黄萎病具有一定抗病能力的地方品种，但是由于黄萎病菌变异快、小种多，具有明显的致病力分化，针对黄萎病菌这种特性的广谱抗性棉花品种基本没有，因此在一个地区表现为抗病的棉种，到不同生理和地理条件下，就出现抗病性丧失的现象。另一方面，陆地棉栽培种内高抗黄萎病的抗源缺乏，直接导致了我国棉花抗黄萎病育种进程缓慢，特别是抗落叶型黄萎病育种基本没有进展。为此，解决生产中抗黄萎病资源缺乏的问题和寻找新的抗病育种方法已迫在眉睫，急需获得具有广谱和持久抗性的抗源以减轻棉花生产中黄萎病造成的巨大损失。

随着分子生物学的发展，利用基因工程分离、克隆和转化抗性基因，不仅可以定向性地改良植物的抗病性，而且基因型来源丰富，不受抗源亲缘关系限制，育种周期短，理论上不存在性状负相关连锁，一次克隆亦可用于多次转化。因此，采用生物技术等多种育种方法，加快抗黄萎病育种进程成为必然。

抗菌蛋白或多肽（AMP，antimicrobial protein or peptide）是一类由生物产生的具有抗菌活性的蛋白或多肽，广泛分布于动物、植物和微生物中，具有抗菌谱广、抗菌活性高和抗性持久等特点。另外，抗菌肽的抗菌机制特别，多以在膜上形成孔道导致细胞内容物泄漏的方式摧毁病原菌，致使病原菌难以产生抗性（Yeaman等，2003）。因此，利用抗菌蛋白或抗菌肽提高植物的抗病性受到广泛关注。植物抗病分子育种策略中，利用来自植物的抗菌蛋白或抗菌肽提高植物的抗病性是最常用的方法之一，因为植物来源的抗菌肽转入植物中更易于受体植物的识别和整合。但是植物来源的抗菌肽转入植物后病原菌易产生抗性或具有病原特异性，因此，要获得对不同生理小种的黄萎病菌具有广谱和持久抗性相对比较困难。而人工合成的非植物源的抗菌蛋白或抗菌肽却能克服植物源抗菌肽的这种不足，但是这类抗菌蛋白或抗菌肽可能会严重影响植物的生长发育。比如，郭余龙等（2003）利用基因枪将抗菌肽基因CEMA转入棉花，转基因棉花叶片呈黄绿相间的条纹状，电镜扫描结果显示，CEMA抗菌肽严重影响叶绿体片层结构。

发明内容

本发明的一个目的是提供既能提高植物的抗病性，又不影响植物生长发育的一种人工合成的抗菌肽基因培育抗黄萎病转基因棉花的方法。

本发明培育抗黄萎病棉花的方法，采用的技术方案是：一种利用人工合成的抗菌肽基因培育抗黄萎病棉花的方法，其特征在于，将人工合成的抗菌肽基因整合入陆地棉栽培种，实现抗菌肽基因spCEMA在转基因棉花中组成型表达，提高棉花对黄萎病的抗病能力。

进一步，所述利用人工合成的抗菌肽基因培育抗黄萎病棉花的方法，包括如下步骤：

步骤1：将CaMV35S启动子控制抗菌肽基因spCEMA的表达元件可操作地插入植物表达载体p5中，构建植物表达载体p5-spCEMA；

步骤2：将上述植物表达载体转入宿主根癌农杆菌，获得转化体；

步骤3：通过转化体将植物表达载体整合入棉花基因组，然后，经过Km抗性愈伤和胚性愈伤的诱导获得体胚，体胚成苗后获得抗黄萎病的spCEMA转基因棉花植株；

步骤4：转基因棉花经室内抗病鉴定和筛选获得对黄萎病抗性的提高，表达适量的转基因棉花材料。

再进一步，步骤3获得的转基因棉花再经过后代性状分离筛选，获得抗病性状稳定遗传的纯合型转基因棉花。

本发明是利用根癌农杆菌介导法将CaMV35S组成型启动子控制spCEMA基因的重组植物表达载体p5-spCEMA导入棉花细胞中，经组织培养、转基因植物分子验证、基因表达检测，以及室内室外的抗病鉴定和筛选获得对黄萎病抗性提高的转基因棉花。