[发明专利]一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法

权利要求书

1.一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，包括：

(1)将酶标板包被加入菠萝蛋白酶溶液孵育，洗涤后加满封阻液，再次洗涤后加入噬菌体7肽文库孵育；用20～100μg/ml菠萝蛋白酶分子TBS洗脱液洗脱并感染10～20ml大肠杆菌ER2738菌液进行扩增8～14h，将菌液离心沉淀后取上清液，加入体积比为1∶3～1∶6的聚乙二醇PEG和NaCl溶液，冰置1～2h，8000～12000rpm离心沉淀10～20min，取上清液，重新悬浮于1～2ml TBS溶液，制得噬菌体TBS溶液；

(2)将上述制备的0.1～1ml噬菌体TBS溶液加入到120～180μl戊二醛溶液中混合均匀，加入120～180μl PEG 6000震荡12-24h，之后加入5～10ml氨基乙醇-HCL，再加1～2ml NaCl溶液，室温震荡1～2h，8000～15000rpm离心沉淀，用TBS溶液洗涤，取上清液，于0～4℃保存，得交联噬菌体7肽亲和吸附介质；

(3)将上述制备的0.01～0.1g交联噬菌体7肽亲和吸附介质溶于体积百分比为0.01～0.02％的NaN₃TBS溶液中，加入10～20ml浓度为4～20mg/ml的菠萝蛋白酶溶液吸附2～4h，8000～15000rpm离心沉淀，用TBST清洗，以TBS/NaCl缓冲液为洗脱剂，洗脱被吸附的菠萝蛋白酶；

(4)测试分离后的菠萝蛋白酶活性和菠萝蛋白酶含量。

2.根据权利要求1所述的一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的大肠杆菌ER2738菌液的浓度为OD₆₀₀＝0.2～0.5。

3.根据权利要求1所述的一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的酶标板包被孔数为96孔。

4.根据权利要求1所述的一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的戊二醛溶液浓度为20～25μM；PEG 6000体积百分比浓度为50％；氨基乙醇-HCL浓度为1～2M，pH值为8.0～9.0；NaCl溶液浓度为4～5M。

5.根据权利要求1所述的一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的洗脱工艺为用pH 5.0～9.0的TBS/NaCl缓冲液于0～40℃进行洗脱。

6.根据权利要求1所述的一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于：所述步骤(4)中测定菠萝蛋白酶活性是利用酪蛋白为底物，在275nm处测定其酶活力大小；测定菠萝蛋白酶含量是使用紫外分光光度计在280nm处进行检测。