[发明专利]一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于纯化菠萝蛋白酶的领域，特别涉及一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法。

背景技术

生物制品随着生物科学技术以及医学的发展，其应用也越来越广泛。但生物制品通常都是从微生物发酵液中或动植物体内提取，再经过一整套分离纯化的工艺流程而制成成品。这些生物产品不同于传统的化工产品，它们一般都具有生物活性，因此对分离操作条件要求更加苛刻，传统的化工分离方法如精馏、沉淀、结晶等都难以在此应用或者效果不理想。而色谱分离也有其缺点：如常用的柱状色谱中，其低流速，高压降，缓慢的动力学吸附过程以及昂贵的成本，这些都遏制了其在产业化中的应用。

同时亲和色谱技术，也遇到了相应的瓶颈问题：市场上对于高纯度的生物大分子的需求也是越来越大，落后的传统色谱技术不能完全跟上市场的需求：分离成本大，纯化时间长，操作工序繁琐。如何找到一个合适的配基，能够一对一单独吸附一种生物大分子比如某种蛋白质或者酶，这是目前色谱领域亟待解决的一个难题。一个理想的配基，要求能与目标生物大分子较强的亲和力，能够可逆的吸附与脱附；同时它又能易于键合到某种介质上，有良好的生物相容性和环境友好性，不易被降解，稳定性；最重要的是它对目标蛋白有定向选择性。这里的定向选择性指的是能够一对一的对目标蛋白或生物大分子有特异亲和性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，该方法工艺简单，成本低廉，重复性好；所筛选的7肽配基能够特异性识别菠萝蛋白酶，以此作为亲和色谱配基能够体现高效性和专一性；分离方法操作简单，快速、高效、分离量大，纯化倍数和酶活性较高，具有良好的应用前景。

本发明的一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，包括：(1)将酶标板包被加入菠萝蛋白酶溶液孵育，洗涤后加满封阻液，再次洗涤后加入噬菌体7肽文库孵育；用20～100μg/ml菠萝蛋白酶分子TBS洗脱液洗脱并感染10～20ml大肠杆菌ER2738菌液进行扩增8～14h，将菌液离心沉淀后取上清液，加入体积比为1∶3～1∶6的聚乙二醇PEG和NaCl溶液，冰置1～2h，8000～12000rpm离心沉淀10～20min，取上清液，重新悬浮于1～2ml TBS溶液，制得噬菌体TBS溶液；

(2)将上述制备的0.1～1ml噬菌体TBS溶液加入到120～180μl戊二醛溶液中混合均匀，加入120～180μl PEG 6000震荡12-24h，之后加入5～10ml氨基乙醇-HCL，再加1～2ml NaCl溶液，室温震荡1～2h，8000～15000rpm离心沉淀，用TBS溶液洗涤，取上清液，于0～4℃保存，得交联噬菌体7肽亲和吸附介质CAPOP；

(3)将上述制备的0.01～0.1g交联噬菌体7肽亲和吸附介质溶于体积百分比为0.01～0.02％的NaN₃ TBS溶液中，加入10～20ml浓度为4～20mg/ml的菠萝蛋白酶溶液吸附2～4h，8000～15000rpm离心沉淀，用TBST清洗，以TBS/NaCl缓冲液为洗脱剂，洗脱被吸附的菠萝蛋白酶；

(4)测试分离后的菠萝蛋白酶活性和菠萝蛋白酶含量。

所述步骤(1)中的大肠杆菌ER2738菌液的浓度为OD₆₀₀＝0.2～0.5。

所述步骤(1)中的酶标板包被孔数为96孔。

所述步骤(2)中的戊二醛溶液浓度为20～25μM；PEG 6000体积百分比浓度为50％；氨基乙醇-HCL浓度为1～2M，pH值为8.0～9.0；NaCl溶液浓度为4～5M。

所述步骤(3)中的洗脱工艺为用pH5.0～9.0的TBS/NaCl缓冲液于0～40℃进行洗脱。

所述步骤(4)中测定菠萝蛋白酶活性是利用酪蛋白为底物，在275nm处测定其酶活力大小；测定菠萝蛋白酶含量是使用紫外分光光度计在280nm处进行检测。

有益效果

本发明工艺简单，成本低廉，重复性好；所筛选的7肽配基能够特异性识别菠萝蛋白酶，以此作为亲和色谱配基能够体现高效性和专一性；分离方法操作简单，快速、高效、分离量大，纯化倍数和酶活性较高，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明操作总流程；

图2是pH对CAPOP吸附量的影响；

图3是离子强度对CAPOP吸附量的影响；

图4是温度与时间对CAPOP吸附量的影响；

图5是响应面条件pH与菠萝蛋白酶浓度对吸附量影响的3D图；