[发明专利]一种萝卜种质抗黑斑病的快速鉴定方法

说明书

技术领域

本发明为园艺作物抗病育种领域，具体涉及一种萝卜种质抗黑斑病的快速鉴定方法。 

背景技术

萝卜黑斑病(Garden radish Alternaria leaf spot)是萝卜种植过程中容易出现的病害，它是由萝卜链格孢(Alternaria Groves et Skoloko)引起的，芸薹链格孢(Alternaria brassicae(Berkveley)Saccvardo)和甘蓝链格孢(Alternaria brassicivcola(Schweinitz)Wiltshire)也能引起该病害的发生，是危害十字花科蔬菜生产的世界性真菌病害。黑斑病通过种子传带形成异地扩散和蔓延，危害叶片和整株植物，全生育过程发病严重影响产量和品质，成为我国甚至世界蔬菜生产的主要病害之一。萝卜黑斑病在许多国家都有发生，尤其是在美国、加拿大、芬兰和中国发生较重。20世纪40年代，它在中国大陆已分布较普遍，对萝卜的生产影响不大，但随后该病的发生日益严重。发病植株的叶片、茎等染病部位呈现褪绿和黑色坏死斑，被侵染的种子发芽率降低，产量和质量下降。从上世纪80年代到现在，黑斑病的流行给我国萝卜中植生产造成了巨大损失，所以近年来控制萝卜黑斑病甚至十字花科黑斑病仍然是生产的重要问题。 

目前，对于黑斑病的研究同黑腐病类似，也是主要从微生物学角度来进行的。国内外研究者们先后通过形态学、酯同工酶分析和分子生物学研究为基础进行分类和鉴定。传统的分类主要是依据链格孢的分生孢子和喙的形态。自1962年科研人员将可溶性蛋白凝胶电泳分析引入脉孢菌的研究以来，真菌菌体的可溶性蛋白图谱和酯酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、乳酸脱氢酶等多种酶系及其同工酶电泳图谱分析作为化学分类的重要手段之一，广泛应用于真菌的分类研究，在病原真菌种级分类上已广泛接受，它在黑斑病的研究上也取得了极大的进展。随着分子生物学方法的应用和对萝卜病菌的DNA序列的研究，PCR、RFLP和RAPD等技术已开始在萝卜种子传带黑斑病菌检测中应用，并逐步实现种子健康检测的规范性、科学性和高通量的统一。 

从抗病育种工作的角度出发，如果能够从萝卜主产区分离出病原菌，建立鉴别寄主并鉴别优势生理小种，筛选抗病品种是有效而又迫切的防控蔬菜病害的主要方法之一，将大大提高我国萝卜产区种植的经济效益。在抗病育种过程中，苗期在室内进行则环境条件较易控制，鉴定周期短、速度快，建立萝卜苗期室内抗黑斑病抗病性鉴定方法有利于抗病育种工作的开展，填补国内萝卜黑斑病抗病育种研究空白。 

发明内容

本发明提供一种萝卜种质抗黑斑病的快速鉴定方法，与大田成株期接种相比，避免了气候条件不适宜、环境中病虫害等因素的影响，苗期在室内进行抗病性筛选则条件较易控制，鉴定周期短、速度快，能节省大量人力物力；确定了适宜的黑斑病悬浮液浓度、萝卜抗病性筛选苗龄。 

本发明采用的技术方案是： 

一种萝卜种质抗黑斑病的快速鉴定方法，其特征在于按以下步骤依次组成： 

(1)供试材料准备 

供试的黑斑病菌种为萝卜链格孢(Alternaria Groves et Skoloko)，菌种接种前用PDA培养基进行产孢培养备用；供试的萝卜品种为春白萝卜、秋白萝卜、耐热红皮和耐热白皮萝卜四种类型萝卜品种；将供试的种子播种在装有灭菌基质的花盆(8cm*8cm)内，出苗后每盆留1-3株。 

(2)接种 

直接采用孢子悬浮液喷雾接种，接种后将供试植株放入塑料盒内，用保鲜膜保湿48h。每供试材料设置3次重复，每次重复30株苗，以清水为对照，设置1.0×10³、1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶pfu/mL四种接种浓度的孢子悬浮液和3-4、5-6、7-8叶期三种苗龄，在20-25℃条件下诱导发病，置于光照培养室中，接种后第7d、第10d与第14d调查病情指数； 

(3)病情指数分级 

病情指数分级以叶片为单位，按0-9级标准进行发病程度调查。病情分级标准：0级：无症；1级：接种叶生褐色小点，无退绿斑；3级：接种叶生3mm以下的退绿斑，无霉层；5级：接种叶生3mm以上的退绿斑，有极少 霉层，病斑不连成片；7级：接种叶生5mm以上的退绿斑，有较多的霉层，病斑连成片以下；9级：接种叶病斑连成片，大面积枯死，霉层明显。