[发明专利]一种利用卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因萝卜的方法

权利要求书

1.一种利用卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因萝卜的方法，其特征在于按以下步骤进行：

(1)材料准备

试验材料为NPTII标记基因的转基因萝卜；

(2)叶片卡那霉素涂抹适宜浓度和观测时间的确定

卡那霉素用附加0.2％吐温20的双蒸水分别配制成0mg/L，250mg/L，500mg/L，750mg/L，1000mg/L，1500mg/L，2000mg/L，2500mg/L浓度的8个处理，每处理重复4次，采用随机区组设计；Kan用毛笔涂抹于植株的完全展开的两片真叶的中间叶片上，湿润即可；分别在涂抹后第3、6、9、12、15天观察记录叶片的反应情况，以确定萝卜叶片的情况，卡那霉素筛选浓度和观察时间；

(3)转基因T₀代萝卜卡那霉素涂抹筛选试验

转基因植株60个株系的后代T₀代种子播种于育苗床，每株系40～150粒种子，当株高达到20～25cm时，按照上述方法用1000mg/L浓度的Kan进行叶片涂抹，12天后调查结果，以处理部位叶面颜色正常为Kan抗性转基因植株，叶面出现褪绿斑点的植株为Kan敏感阴性植株；

(4)Kan涂抹结果的PCR检测验证

为检测Kan涂抹结果的可靠性，随机挑选4个等级的68个转化植株和1个未转化的植株为阴性对照，小量法抽提DNA，设计引物进行PCR扩增，扩增条带为769bp，扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中Kan叶片涂抹田间筛选的最佳浓度为1000mg/L，观察时间为12天。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的步骤(4)中设计引物具体为：P1：5’-AGCCGTTTGTTAGTGCCT-3’；P2：5’-ACTTGGATGCGGATGGAC-3’。