[发明专利]一种利用卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因萝卜的方法

说明书

技术领域

本发明为转基因作物育种领域，具体涉及一种利用卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因萝卜的方法

背景技术

萝卜(Raphanus sativus L.)，别名莱菔，芦菔，属十字花科萝卜属，根部为主要肉食器官，营养丰富，世界各地均有栽培。

萝卜的转基因工作还处于起步阶段，对于转化材料的筛选与鉴定，使用传统的分子检测方法不仅工作量大、成本高，且不易操作。同时，对于获得的植株还要对其后代的遗传规律进行研究，这些都需要大量的转基因后代的筛选和鉴定工作。因此，利用简便的标记基因进行转基因植株的快速检测方法已越来越受到重视。卡那霉素(Kanamycin，简写Kan)是目前被广泛应用于植物遗传转化的选择标记基因，卡那霉素多用于组织培养阶段对转化植株进行初步筛选，再利用PCR、Southern blot杂交等方法检测目的基因是否整合到植物基因组中。

卡那霉素田间快速筛选转基因植株的方法，在转基因棉花、大豆、番茄、水稻、小麦中已有报道，但在转基因萝卜植株的筛选方面尚未见报道。卡那霉素田间快速选择的效果因植物种类，以及对应的涂抹浓度、观测时间而变化很大。为此，此试验以带有NPTⅡ标记基因的转基因萝卜为材料，利用不同浓度卡那霉素叶片进行叶片涂抹，以确定其适宜的涂抹浓度和观测时间，并对卡那霉素涂抹方法的可靠性进行了PCR验证，其结果对于实现萝卜田间转基因植株的规模化快速选择、加快育种进程具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种利用卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因萝卜的方法，确定了Kan叶片涂抹田间筛选的最佳浓度、观察时间；经PCR检测验证，Kan筛选抗性苗的阳性检测率达到93.8％。研究建立 了一种在田间对转基因萝卜进行大量筛选的简便方法，对于转基因萝卜材料的选育具有重要价值。

本发明采用的技术方案是：一种卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因萝卜的方法，其特征在于按以下步骤进行：

(1)材料准备

试验材料为NPTⅡ标记基因的转基因萝卜(为市售产品，购买于湖北省农业科学院经济作物研究所；也可通过常规基因工程技术获得Bt基因构建于质粒pCMIaN中，选择标记为NPTⅡ基因，农杆菌菌株转化)

(2)叶片卡那霉素涂抹适宜浓度和观测时间的确定

卡那霉素用附加0.2％吐温20的双蒸水分别配制成0mg/L，250mg/L，500mg/L，750mg/L，1000mg/L，1500mg/L，2000mg/L，2500mg/L浓度的8个处理，每处理重复4次，采用随机区组设计；Kan用毛笔涂抹于植株的完全展开的两片真叶的中间叶片上，湿润即可。分别在涂抹后第3、6、9、12、15天观察记录叶片的反应情况，以确定萝卜叶片的情况，卡那霉素筛选浓度和观察时间。

(3)转基因T₀代萝卜卡那霉素涂抹筛选试验

转基因植株60个株系的后代T₀代种子播种于育苗床，每株系40～150粒种子，当株高达到20～25cm时，按照上述方法用1000mg/L浓度的Kan进行叶片涂抹，12天后调查结果，以处理部位叶面颜色正常为Kan抗性转基因植株，叶面出现褪绿斑点的植株为Kan敏感阴性植株。

(4)Kan涂抹结果的PCR检测验证

为检测Kan涂抹结果的可靠性，随机挑选4个等级的68个转化植株和1个未转化的植株为阴性对照，小量法抽提DNA，并利用BtCry1Ia基因的引物P1：5’-AGCCGTTTGTTAGTGCCT-3’；P2：5’-ACTTGGATGCGGATGGAC-3’进行PCR扩增，扩增条带为769bp，扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。

所述的Kan叶片涂抹田间筛选的最佳浓度为1000mg/L，观察时间以12天为宜。

本发明取得的有益效果：

经PCR检测验证，Kan筛选抗性苗的阳性检测率达到93.8％。研 究建立了一种在田间对转基因萝卜进行大量筛选的简便方法，对于转基因萝卜材料的选育具有重要价值。

具体实施方式

下面对本发明作一详细说明：

实施例：

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1植物材料

(1)材料准备

试验材料为NPTⅡ标记基因的转基因萝卜(为市售产品，购买于湖北省农业科学院经济作物研究所；也可通过常规基因工程技术获得Bt基因构建于质粒pCMIaN中，选择标记为NPTⅡ基因，农杆菌菌株转化)

1.2叶片卡那霉素涂抹适宜浓度和观测时间的确定