[发明专利]赖氨酸的发酵制备

说明书

技术领域

本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及L-赖氨酸的发酵方法，其包括将编码二氢吡啶二羧酸合成酶变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体；和在发酵条件下培养获得的菌。另外，本发明还提供了所述发酵方法中所用的中间产物，和利用所述发酵方法进一步生产产品等。

背景技术

L-赖氨酸是重要的氨基酸原料，可以作为调味品、食品、饲料添加剂使用，也可以作为保健品、药品中的有效或辅料成分，广泛应用于食品业、饲料业、制药业及其他化学工业中。当前，L-赖氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌生产。

用于发酵生产的微生物可以是野生型微生物，但是更多的是通过诱变或基因工程获得的产量更高的营养缺陷型、耐药变异型和代谢变异型微生物。对于基因工程获得的性状改良的微生物来说，其中至关重要的就是性质优异的基因。

二氢吡啶二羧酸合成酶变体是L-赖氨酸代谢途径上重要的酶。尽管野生型吡二氢吡啶二羧酸合成酶及其部分变体已经被公开(可参见NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)蛋白和基因登录号AAC75531.1；也可参见中国专利ZL94194962)，但是该酶的其他变体的研究却没有报道，也没有启示在新的位点上突变。

本发明人经过长期艰苦研究，令人意外地发现了新的二氢吡啶二羧酸合成酶，其在导入工程菌发酵的时候也获得了更高的赖氨酸产量。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供L-赖氨酸的发酵方法，其包括将编码二氢吡啶二羧酸合成酶变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体。另外，本发明还提供了所述发酵方法中所用的中间产物，和利用所述发酵方法进一步生产产品等

具体而言，在第一方面，本发明提供了L-赖氨酸的发酵方法，其包括：

(1)将编码二氢吡啶二羧酸合成酶变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体，其中所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体在野生型二氢吡啶二羧酸合成酶的M13、V60或A83的位置上被其他天然氨基酸替换；和

(2)在发酵条件下培养步骤(1)获得的菌。

其中，野生型二氢吡啶二羧酸合成酶是本领域技术人员所知晓的，其序列如NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)蛋白和基因登录号AAC75531.1所示。

优选本发明第一方面的发酵方法中，所述多核苷酸编码二氢吡啶二羧酸合成酶变体，如其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

优选本发明第一方面的发酵方法中，所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体在野生型二氢吡啶二羧酸合成酶的M13、V60和A83的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换选自M13K、V60L和A83G。在本发明的具体实施方式中，所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

本领域技术人员可以根据二氢吡啶二羧酸合成酶变体的氨基酸序列推导出其编码核苷酸序列，优选是密码子优化的核苷酸序列，如针对发酵所用的菌密码子使用情况优化的。在本发明的具体实施方式中，所述二氢吡啶二羧酸合成酶变体由如SEQ ID No：2所示的多核苷酸编码。

所述多核苷酸可以通过各种本领域技术人员所熟知的方式被导入产L-赖氨酸的菌，只要能够使产L-赖氨酸的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶变体即可。所述多核苷酸可以直接被导入，例如利用微粒体、基因枪等导入细胞；也可以间接被导入，例如可以通过构建在质粒载体上导入细胞。导入的所述多核苷酸可以整合在细胞的基因组上表达，也可以游离表达。通常，由于产L-赖氨酸的菌本身不适于作为克隆宿主菌，因此优选所述多核苷酸是通过穿梭质粒导入产L-赖氨酸的菌的。其中，所述穿梭质粒优选是大肠杆菌和产L-赖氨酸的菌的穿梭质粒。这样便能够很方便地在大肠杆菌宿主中进行DNA重组操作。

产L-赖氨酸的菌有许多种，本领域技术人员所知晓的包括埃希氏杆菌、棒状杆菌和沙雷氏杆菌，优选是棒状杆菌。在本发明的具体实施方式中，所述产L-赖氨酸的菌是Corynebacterium glutamicum。

优选本发明第一方面的发酵方法中，所述发酵条件的发酵温度为28-35℃，优选为29-33℃，更优选为30-32℃，如30℃。