[发明专利]多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒及制备方法

权利要求书

1. 一种多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒，包括以下部分：

（1）样本裂解液与DNA提取试剂

样本裂解液：NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；其中，浓度配比为：NaCl 100mM、Tris-HCl(pH 7.5)20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2%（w/v）和蛋白酶K 0.1μg/μl；

DNA提取试剂为酚:氯仿:异戊醇（24:25:1）；

（2）荧光定量PCR反应液：含反应终浓度各100-300μM的4种dNTPs，反应终浓度各10-100pmol/μl的引物，反应终浓度为10-100pmol/μl的探针，1.5-4.5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌蒸馏水；

（3）多重引物及探针：

蓝氏贾第虫：

Ga：5'- GGCATCTTCATTCATAGACCTTCTG -3'

Gs：5'-ATATGCTGACATCTGGAGGAAAATC-3'

G-probe：5'-FAM-TCTTCCGTCTCGCCGTAACTGGTAA-BHQ1-3'

微小隐孢子虫：

Ca：5'-ATTGAAATAGATTCTGGTCCTTTGG-3'

Cs：5'-CATATTCCCTGTCCCTTGAGTTG-3'

C-probe：5'-JOE-CCGACCTCTCTCTCATTTGGTGACC-BHQ1-3'

刚地弓形虫：

Ta：5'-ATTTGCCAGCGGGAAATACAG-3'

Ts：5'-CCACAAGACGGCTGAAGAATG-3'

T-probe：5'-Cy5-TTCTTGTGCTGCCTCCTCTCATGG-BHQ2-3'；

（4）阳性对照：蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫检测片段标准质粒；

（5）阴性对照：取灭菌蒸馏水为阴性对照样本；

（6）多重荧光定量PCR标准曲线：通过阳性标准质粒进行荧光定量PCR扩增绘制。

2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还含有smart cycler system PCR反应管。

3.权利要求1所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）样本裂解液与DNA提取试剂

样本裂解液：将NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K制成混合溶液；其中，浓度配比为：NaCl 100mM、Tris-HCl(pH 7.5)20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2%（w/v）和蛋白酶K 0.1μg/μl；DNA提取试剂为酚:氯仿:异戊醇（24:25:1）；

（2）多重荧光定量PCR引物与探针：

蓝氏贾第虫特异引物Ga与Gs及探针G-probe，微小隐孢子虫特异引物Ca与Cs及探针C-probe，刚地弓形虫特异引物Ta与Ts及探针T-probe；

（3）荧光定量PCR反应液为2×预混液，含反应终浓度各100-300μM的4种dNTPs，反应终浓度各10-100pmol/μl的引物，反应终浓度为10-100pmol/μl的探针，1.5-4.5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌双蒸水；

（4）阳性对照样本标准质粒为含有蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫种特异基因的pMD-18T重组质粒；

（5）阴性对照：取灭菌蒸馏水为阴性对照样本；

（6）组装试剂盒。