[发明专利]多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒及制备方法

说明书

技术领域

本发明公开一种多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒，用于蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫的快速荧光定量PCR检测，本发明还提供了该试剂盒的制备方法，属于寄生虫检测技术领域。

背景技术

贾第虫病(giardiasis)是由贾第虫引起的一种以腹泻为主要症状的肠道疾病，为一种严重的人兽共患病，该病已被列为危害人类健康的10种主要寄生虫病之一。

隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）是由隐孢子虫所引起的一种危害严重的人兽共患原虫病，可造成哺乳动物尤其是反刍动物以及人的严重腹泻。目前已经命名隐孢子虫有27种，能感染人的隐孢子虫有多种，其中以微小隐孢子虫的感染最为常见和严重，微小隐孢子虫宿主范围广泛且危害严重，多感染人、家畜等哺乳动物，因此是隐孢子虫属中危害最大的隐孢子虫种。病原学诊断多通过粪便显微镜检及改良的抗酸染色法检查，此法费时费力且检出率低下。免疫学诊断特异性和敏感性也较低。

弓形虫病（toxoplasmosis）又称弓形体病，是由刚地弓形虫（Toxophasma gondii）所引起的人畜共患病，可感染人及家畜，猫科等多种哺乳动物。病原可通过胎盘感染胎儿，直接影响胎儿发育，致畸严重，其危险性较未感染者大10倍，是畜牧业的重大威胁，也是人类先天性感染中最严重的疾病之一，已引起广泛重视，本病与艾滋病（AIDS）的关系亦很密切。

上述三种病的病原体分别为蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫，均为细胞内寄生原虫，其卵囊或包囊均较小，镜检不易发现，且其病原体在污染的水中存活时间持久，难以被普通消毒剂杀灭，因此给疾病诊断、病原检测和环境监测带来较大的困难，亟需开发一种多重快速检测试剂盒。

发明内容

本发明提供一种多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒，可用于蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫三种原虫的同时快速检测和诊断。

本发明进一步提供了上述试剂盒的制备方法。

本发明的多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒，包括以下部分：

（1）样本裂解液与DNA提取试剂

样本裂解液：NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；其中，浓度配比为：NaCl 100mM、Tris-HCl(pH 7.5)20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2%（w/v）和蛋白酶K 0.1μg/μl；

DNA提取试剂为酚:氯仿:异戊醇（24:25:1）；

（2）荧光定量PCR反应液：含反应终浓度各100-300μM的4种dNTPs，反应终浓度各10-100pmol/μl的引物，反应终浓度为10-100pmol/μl的探针，1.5-4.5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌蒸馏水；

（3）多重引物及探针：

蓝氏贾第虫：

Ga：5'- GGCATCTTCATTCATAGACCTTCTG -3'

Gs：5'-ATATGCTGACATCTGGAGGAAAATC-3'

G-probe：5'-FAM-TCTTCCGTCTCGCCGTAACTGGTAA-BHQ1-3'

微小隐孢子虫：

Ca：5'-ATTGAAATAGATTCTGGTCCTTTGG-3'

Cs：5'-CATATTCCCTGTCCCTTGAGTTG-3'

C-probe：5'-JOE-CCGACCTCTCTCTCATTTGGTGACC-BHQ1-3'

刚地弓形虫：

Ta：5'-ATTTGCCAGCGGGAAATACAG-3'

Ts：5'-CCACAAGACGGCTGAAGAATG-3'

T-probe：5'-Cy5-TTCTTGTGCTGCCTCCTCTCATGG-BHQ2-3'；

（4）阳性对照：蓝氏贾第虫、微小隐孢子虫和刚地弓形虫检测片段标准质粒，比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确。

（5）阴性对照：取灭菌蒸馏水为阴性对照样本，目的在排除反应液中的核酸污染和操作过程中的假阳性问题。

（6）多重荧光定量PCR标准曲线：通过阳性标准质粒进行荧光定量PCR扩增绘制。

在本发明的试剂盒中还可以含有smart cycler system PCR反应管。

本发明所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）样本裂解液与DNA提取试剂