[发明专利]斜纹夜蛾基因工程病毒2号及其构建方法

权利要求书

1.一种斜纹夜蛾基因工程病毒，其特征在于：是对野生型病毒SpltMNPV                                                 进行缺失和重组得到的斜纹夜蛾基因工程病毒，其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号：CCTCC NO:V201028；分类命名：斜纹夜蛾基因工程病毒2号(SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp )；在其基因组中缺失了egt基因即蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因，在缺失egt基因的位点处，插入由野生型病毒SpltMNPV  的多角体蛋白基因ph启动子控制的东亚钳蝎毒BmK ITa1基因和由野生型病毒SpltMNPV 的多角体蛋白基因ph启动子控制的标记基因即增强型绿色荧光蛋白egfp基因。

2.一种构建如权利要求1所述的斜纹夜蛾基因工程病毒2号（SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp）的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）构建重组质粒 pSK-△egt-Pph- egfp：

以SpltMNPV  DNA为模板，分别扩增出同源重组臂egt上游非编码端（Egt up）和 egt3′端的部分序列及其下游非编码端(Egt down)；扩增产物回收纯化后分别经Kpn I /Xho I， Xba I/ Sac I双酶切后依次克隆到载体pBluescript II SK(+)上，获得中间质粒pSK- Egtup- Egtdown；

在这两个片段之间，采用分子克隆技术插入SpltMNPV 的多角体蛋白基因启动子启动Pph控制的增强型绿色荧光蛋白基因egfp，获得重组质粒 pSK-△egt-Pph- egfp；

（2）构建重组转移载体pSK-△egt-Pph- egfp-Pph-Bmk：

在BmK ITa1基因前引入AcMNPV BV膜融合蛋白GP64的同系物，SpltMNPV  的F蛋白的信号肽signalP序列；以SpltMNPV  DNA为模板，扩增出signalP序列，克隆到pBacPAK8中，得到pBacPAK8-signalP；再将SpltMNPV 的多角体蛋白基因启动子Pph克隆到pBacPAK8-signalP中，得到中间质粒pBacPAK8-Pph-signalP；

以pMD18-BmK ITa1为模板，采用PCR扩增出BmK ITa1片段，克隆到pBacPAK8-Pph-signalP中，得到pBacPAK8-Pph-signalP-BmK；

以Sma I和Xba I双酶切，切下Pph-signalP-BmK片段并插入到pSK-△egt-Pph- egfp 中的egfp基因和egt3’非编码端之间，得到重组转移载体pSK-△egt-Pph- egfp-Pph-Bmk；

（3）共转染、纯化，得到基因工程病毒SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp ：

将pSK-△egt-Pph- egfp-Pph-Bmk和SpltMNPV  基因组DNA共转染斜纹夜蛾Spli细胞，通过基因等位交换，获缺失egt基因的以绿色荧光蛋白为标记的表达BmK ITa1的重组病毒SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp；经多轮荧光斑法纯化处理，得到纯的重组病毒即斜纹夜蛾基因工程病毒2号（SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp）CCTCC NO:V201028。