[发明专利]斜纹夜蛾基因工程病毒2号及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是一种能够防治斜纹夜蛾等农林害虫的斜纹夜蛾基因工程病毒，即“斜纹夜蛾基因工程病毒2号” (SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp)，分类名称是“斜纹夜蛾核型多角体病毒基因工程株2号”(Genetically modified Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus No.2)。该病毒由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2010年12月15日 ，保藏号是CCTCC NO：V201028。

背景技术

斜纹夜蛾是农作物的主要害虫之一，国内各省区均有分布。该虫食性极广，已知可危害的寄主植物达99科290多种。近年来随着农业耕作制度的改变和城市化进程的快速发展，蔬菜、花卉、绿化草坪等旱地作物的种植面积越来越多，斜纹夜蛾的为害也日益猖獗。当前生产上采用的化学防治往往达不到预期效果，而且容易造成环境污染、农药残留和人畜中毒等。

随着国民经济的不断发展和人民生活水平的日益提高，人们对于各种农产品的质量要求越来越高，特别是产品的安全性问题已受到广泛的关注和重视。目前，在各种农作物病虫害的防治工作中，过度依赖化学农药的情况仍然十分严重，由此带来了害虫抗性、再猖獗和环境污染等问题，直接影响到人类的食品安全和生存环境。因此，大力发展高效、广谱、与环境相容性好的无公害生物农药是农业可持续发展的需要。

斜纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus， SpltMNPV)已用于斜纹夜蛾的防治。但由于它存在杀虫速度慢的缺陷，影响了其推广应用。为了改变野生型昆虫杆状病毒杀虫速度慢的缺陷，上世纪90年代以来，国内外已有多种重组昆虫杆状病毒问世，如文献中公开的美国重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(rAcMNPV Stewart L M D et al 1991.Nature,352:85-88)，公开号为CN1109105C的中国发明专利“中国棉铃虫基因工程病毒”(rHaSNPV，)。然而，迄今为止，国内外尚未见有关斜纹夜蛾核型多角体基因工程病毒构建成功的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种能有效提高野生病毒杀虫速度和效果的斜纹夜蛾核型多角体基因工程病毒及其构建方法。

本发明的目的是按下述方案实现的：提供一种斜纹夜蛾基因工程病毒，是对野生型病毒SpltMNPV                                                 进行缺失和重组得到的斜纹夜蛾基因工程病毒，其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号：CCTCC NO:V201028；分类命名：斜纹夜蛾基因工程病毒2号(SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp )；在其基因组中缺失了egt基因即蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因，在缺失egt基因的位点处，插入由野生型病毒SpltMNPV  的多角体蛋白基因ph启动子控制的东亚钳蝎毒BmK ITa1基因和由野生型病毒SpltMNPV 的多角体蛋白基因ph启动子控制的标记基因即增强型绿色荧光蛋白egfp基因。

构建上述斜纹夜蛾基因工程病毒2号的方法，包括以下步骤：

（1）构建重组质粒 pSK-△egt-Pph- egfp：

以SpltMNPV  DNA为模板，分别扩增出同源重组臂egt上游非编码端（Egt up）和 egt 3′端的部分序列及其下游非编码端(Egt down)。扩增产物回收纯化后分别经Kpn I /Xho I， Xba I/ Sac I双酶切后依次克隆到载体pBluescript II SK(+)上。获得中间质粒pSK- Egtup- Egtdown；

在这两个片段之间，采用分子克隆技术插入SpltMNPV 的多角体蛋白基因启动子启动Pph控制的增强型绿色荧光蛋白基因egfp，获得重组质粒 pSK-△egt-Pph- egfp；