[发明专利]一种获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法

权利要求书

1.一种获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法，其特征在于，步骤如下：

A.构建植物表达载体p121-Cre-Gus，转化根癌农杆菌LBA4404，在28℃下在含100mg·L^-1卡那霉素的LB液体培养基中培养16小时；

B.将平邑甜茶的组织培养苗在继代培养基上培养35天，之后在无菌条件下取组织培养伸展叶片，剪成面积约0.1cm²的叶盘，放在步骤A得到的培养物中5分钟，然后接种在再生培养基上，黑暗条件培养下1天；

C.将经过步骤B培养的平邑甜茶叶盘转接在含300mg·L^-1头孢霉素的分化培养基上，在温度(25±1)℃下暗培养14天，然后置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30μmol·m^-2·s^-1的条件下再培养30天，获得转化芽；

D.将步骤C中获得的转化芽切下，接种在生根培养基上，置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30μmol·m^-2·s^-1的条件下培养40天，即可完成生根；

E.取步骤D中得到的转基因植株的幼叶进行PCR和GUS鉴定；

F.将步骤D中得到的转基因植株置于42℃下热处理15分钟，再取其幼叶进行进一步PCR鉴定，获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株；

所述植物表达载体p121-Cre-Gus的序列如序列表SEQ ID：No.1所示；

所述继代培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L^-1蔗糖、6.5mg·L^-1琼脂粉、0.3mg·L^-16-苄基腺嘌呤和0.1mg·L^-1萘乙酸，pH5.6的培养基；

所述再生培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L^-1蔗糖、6.5mg·L^-1琼脂粉、2.0mg·L^-1N-苯基-N’-1，2，3-噻二唑-5-脲和0.2mg·L^-1吲哚丁酸，pH5.6的培养基；

所述分化培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L^-1蔗糖、6.5mg·L^-1琼脂粉、300mg·L^-1头孢霉素、5mg·L^-1卡那霉素、2.0mg·L^-1N-苯基-N’-1，2，3-噻二唑-5-脲和0.2mg·L^-1吲哚丁酸，pH5.6的培养基；

所述生根培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L^-1蔗糖、6.5mg·L^-1琼脂粉和0.4mg·L^-1吲哚丁酸，pH5.6的培养基。

2.一种用于获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法中的植物表达载体p121-Cre-Gus，其特征在于，其序列如序列表SEQ ID：No.1所示。