[发明专利]一种获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种产生转基因平邑甜茶植株的方法，特别地，是一种产生无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法。

背景技术

平邑甜茶[Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.var.pingyiensis Jiang]是苹果属湖北海棠种的一个变种，是典型的具有兼性无融合生殖性状的植物，也是我国特有苹果砧木资源；其树性乔化，耐荫、抗涝能力强，嫁接苹果的亲和力强，是目前苹果生产中已被广泛应用的砧木之一。由于无融合生殖的特点，使得平邑甜茶的传统育种较为困难，通过转基因技术可以平邑甜茶进行性状改良。而在转基因过程中常常用到选择标记基因，它常与目的基因共转化，在选择压的作用下，非转化细胞被杀死，而转化细胞由于获得标记基因的抗性而成活下来，并进一步增殖分化，形成转基因植株，这对转基因植株的获得至关重要。但转基因植株一旦再生成功，标记基因便不再有用，甚至是有害的。因此培育无标记转基因平邑甜茶，目前已成为平邑甜茶分子育种的重要目标，而国内外还没有平邑甜茶这方面的报道。

发明内容

本发明提供一种产生转基因平邑甜茶植株的方法，特别地，是一种产生无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法，其步骤如下：

A.构建植物表达载体p121-Cre-Gus，转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，在28℃下在含100mg·L^-1卡那霉素的LB液体培养基中培养16小时；

B.将平邑甜茶组织培养苗在继代培养基上培养35天，之后在无菌条件下取组织培养伸展叶片，剪成面积约0.1cm²的叶盘，放在步骤A得到的培养物中5分钟，然后接种在再生培养基上，黑暗条件培养下1天；

C.将经过步骤B培养的平邑甜茶叶盘转接在含300mg·L^-1头孢霉素的分化培养基上，在温度(25±1)℃下暗培养14天，然后置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30μmol·m^-2·s^-1的条件下再培养30天，获得转化芽；

D.将步骤C中获得的转化芽切下，接种在生根培养基上，置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30μmol·m^-2·s^-1的条件下培养40天，即可完成生根；

E.取步骤D中得到的转化植株的幼叶进行PCR和GUS鉴定获得转基因植株；

F.将步骤D中得到的转基因植株置于42℃下热处理15分钟，再取其幼叶进行进一步PCR鉴定，获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株。

所述平邑甜茶的组织培养苗可以按照以下步骤得到：初春采平邑甜茶一年生枝条，水培养10天左右，取枝条上饱满的芽，流水冲洗3小时，用0.1％的升汞(HgCl₂)处理6分钟，无菌水冲洗6次，用无菌吸水纸吸干残留水分，将芽接种到初代培养基上；在接种后的第二天开始有部分材料开始褐化，一旦发现有褐化的材料，马上更换为新的初代培养基，直到褐化消除；接种10天时，饱满的芽都开始萌发，40天时长成约4cm左右的组培苗。

所述将植物表达载体p121-Cre-Gus转化根癌农杆菌LBA4404可以按照以下步骤操作：

a.分别取5-10μL的载体p121-Cre-Gus和100μL根癌农杆菌感受态LBA4404加在1.5uL的离心管中，混匀，冰上放置30分钟；

b.液氮中速冻2-3分钟，37℃水浴3分钟；

c.再加入800LB液体培养基(不含抗生素)，在28℃条件下，180转培养2-4小时；

d.然后5000转/分离心5分钟，离心管底部留100uL，混匀涂布在含100mg·L^-1卡那霉素的LB固体培养基上；

e.挑出长出的单菌落，经PCR鉴定为阳性的根癌农杆菌LBA4404即可转化植物材料。

所述LB液体培养基为10mg·L^-1蛋白胨、5mg·L^-1酵母提取物、10mg·L^-1NaCl，pH7.0的培养基。