[发明专利]DNA标签及其在构建和测序配对末端标签文库中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及第二代高通量测序，特别是对配对末端文库进行混合测序的领域。更具体地，本发明涉及DNA标签及其在构建和测序配对末端标签文库中的应用。

背景技术

配对末端文库(mate-paired library)测序是指通过构建大片段文库，获得较大跨度(2-10kb)片段两端的序列。这种从较大跨度两端所获得的序列对大基因组或者复杂基因组的组装和基因组结构变异的发掘具有非常重要的作用，特别适合于新基因组测序(De novo sequencing)项目。目前，ABI SOLiD测序平台提供的配对末端文库制备方法(Applied Biosystems SOLiD^TM 4 System Library Preparation Guide P/N 4445673)如图1所示，其包括步骤：(1)片段化大核酸分子，产生目标核酸；(2)对片段化的目标核酸进行纯化和精修(End-Polishing)；(3)将帽接头(Cap Adaptor)连接至片段化的目标核酸的两个末端，以形成连接物标记的目标核酸；(4)通过生物素化的中间接头(Internal Adaptor)将上述连接有帽接头的核酸片段环化连接，形成带有生物素标记的环形分子产物；(5)在目标核酸区片段化所述环形核酸分子，产生含目标核酸的两个末端区的DNA构建体；(6)通过生物素-链霉亲和素亲和作用，使用链霉亲和素磁珠富集目标核酸片段；(7)对富集的目标核酸片段进行精修，并用接头P1和接头P2进行平末端连接，然后进行PCR扩增以形成配对末端文库。接着，对配对末端文库的测序包括：使用乳液PCR(emPCR)法将文库模版扩增到1μm的磁珠上，在单个磁珠上形成包含4-6万条分子模板的单克隆分子簇；对模板磁珠进行修饰，然后将其涂布在测序芯片上进行测序；其中第一个配对末端区(TAG1)利用和P1接头特异配对的一组测序引物进行测序，第二个配对末端区(TAG2)利用与中间接头和帽接头特异配对的一组测序引物进行测序。图2显示的是SOLiD测序平台对2×50配对末端文库的测序流程(Applied Biosystems SOLiD^TM 4 System Library Preparation Guide P/N 4445673)。

DNA标签文库测序可最大化测序容量，减少样品制备流程，实现对多个DNA样品的混合测序。目前，在SOLiD系统中，在单分区芯片上对多个样品进行混合测序利用的是Barcode技术(SOLiD^TM System Barcoding)。图3为将SOLiD Barcodes整合到片段文库或配对末端文库的流程图。特别地，对于配对末端文库而言，文库构建的前期流程与图1相同，但在进行P1和P2接头连接步骤时，对P2接头进行修饰，即，添加SOLiD-Barcode序列以用于区分和识别样品，从而实现多个DNA样品的混合测序。具体地，在P2接头的连接位置附近添加一段由5-10个特异碱基组成的Barcode序列，从而在文库制备过程中，随着P2接头的连接，Barcode序列相应地被引入到待测序列的3′端；不同的样品对应不同的Barcode序列，从而对未知DNA序列和已知的Barcode序列的测序，使得能够利用不同的Barcode序列来区分不同样品的数据(参见图3右侧)。

目前，SOLiD Barcode s技术只在随机片段文库的混合测序中得到应用(SOLiD^TM 4 System Library Preparation Quick Reference Card P/N 4445674B，Multiplex Sequencing on the SOLiD^TM Platform with10，16，or 96 Barcodes)，其中，通过2次独立的测序反应，分别测定目标序列(TAG1)和Barcode序列(参见图3左侧)。在理论上，也可将SOLiD Barcode技术应用于多个配对末端文库的混合测序，其中必须分别对两段目标序列(TAG1和TAG2)及Barcode进行3次独立的测序反应(参见图3右侧)。然而，一方面，3次独立的测序反应导致测序成本大大提高；另一方面，在现有的SOLiD测序技术中，用于测定Barcode的引物序列和用于测定配对末端的TAG2区的引物序列是完全一致的，因此，不可能在同一个测序流程中既测定TAG2，又测定Barcode序列(相同的测序引物导致无法区分测序结果)。因此，到目前为止，SOLiD Barcoding技术还没有正式应用于多个配对末端文库的混合测序。