[发明专利]一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属体外诊断试剂技术领域，特别是涉及一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒。

背景技术

解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，UU)是一类原核细胞微生物，体积介于细菌与病毒之间，是人类泌尿生殖道的常见病原体，与许多泌尿生殖道感染症、围产期感染和不育症都有关系，是性传播疾病的病原体之一。值得注意的是，在孕妇中解脲脲原体感染者较多，国外有报道为80％，而我国有报道为55.12％。在这个时期感染解脲脲原体，不仅危害母体健康，而且危害胎儿生存，很容易发生低体重儿、新生呼吸道感染、中枢神经系统感染、胎儿死亡等严重后果。

解脲脲原体感染后，患者大多无明显症状，很难被患者觉察，也易造成医生漏诊，因此实验室检测是临床诊断的重要辅助手段。目前，解脲脲原体的实验室检测方法主要有细胞生物学检测方法(如培养和镜检)、免疫学检测方法(如抗原检测法)和分子生物学方法(如PCR和实时荧光定量PCR法)。然而细胞生物学法耗时费力，操作技术高；免疫学检测方法(如抗原检测法)特异性差，灵敏度低，都不利于早期的临床快速、特异诊断。分子生物学方法主要为PCR法。PCR属于一种核酸体外扩增技术，用寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增。PCR技术不但能检测尿道或宫颈拭子标本，而且可以采用尿标本进行检测。但尿中可能存在扩增的抑制物，从而影响PCR的敏感性。除了尿中的抑制物会影响PCR的敏感性，导致出现假阴性结果外，PCR的另外一个缺点是容易造成假阳性污染，并且对用药后康复的病人检测结果仍出现阳性结果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，该检测试剂盒检测UU菌的分析灵敏度为50CFU/反应，特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境下易于降解而污染低。

本发明的一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，包括：

(1)尿样保存液：含有硫酸铵和去垢剂；

(2)核酸提取液：含有磁性颗粒和捕获探针；

(3)UU反应液：含dNTPs和NTPs扩增所需组份；

(4)UU检测液：为恒温扩增时必需的UU引物和UU荧光探针溶解在TE溶液(10mMTris和1mM EDTA的混合液)中配制而成；其中UU检测液中的引物包含有以下一对或几对序列：UU T7：序列见序列表SEQ.ID.NO3-6；UU nT7：序列见序列表SEQ.ID.NO7-10；UU检测液中的探针包含有以下一种或几种序列：UU probe：序列见序列表SEQ.ID.NO11-12；

(5)SAT酶液：为恒温扩增时的多酶组分体系，含T7 RNA聚合酶200～2000U/反应、M-MLV反转录酶400～4000U/反应、2～10mM HEPES pH7.5、10～100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04～0.4mM zinc acetate、10～100mM trehalose、40～200mM Tris-HCl pH 8.0、40～200mMKCl、1～10mM EDTA、2～20％(v/v)Triton X-100、10～40％(v/v)glycerol；

(6)UU阳性对照：为失活的UU菌，浓度为2×10⁵CFU/ml；

(7)UU阴性对照：为不含有SEQ.ID.NO13核酸序列或不含有解脲脲原体的溶液。

所述的试剂盒还包括洗涤液。

所述的洗涤液为含十二烷基磺酸钠(SDS)、NaCl和乙醇的溶液，具体包含SDS 0.1～1％，NaCl 10～150mM，乙醇0.1～1％。

尿样保存液主要有效成分是硫酸铵和去垢剂，高浓度去垢剂的存在能够使RNase迅速失活，有效保存RNA。另外，尿样保存液中高浓度盐离子及去垢剂的存在，通过蛋白质变性使菌体细胞破裂，靶标RNA得到了释放，样本放在该保存液中，延长了样本的保存时间，RNA从细胞中释放出来。

尿样保存液为裂解和保存尿液或生殖道拭子洗涤液标本中解脲脲原体(UU)RNA的表面活性剂和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液，具体包括0.1～10M硫酸铵；0.15～1MHEPES。