[发明专利]一种重组人凝血酶在动物细胞内的高效表达和生产方法

权利要求书

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白是人蛋白C的信号肽序列与缺失Gla结构域的人凝血酶形成的融合蛋白。

2.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

3.一种编码权利要求1所述的融合蛋白的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:5所示。

5.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求3所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞携带权利要求5中所述的表达载体，或者所述宿主细胞的基因组中整合有权利要求2所述的的多核苷酸。

7.一种制备人凝血酶的方法，其特征在于，包括步骤：

培养权利要求6所述的宿主细胞，从而表达所述的融合蛋白，并分泌形成人前凝血酶-2； 

分离或纯化出所述的分泌的人前凝血酶-2；和

对上一步骤中获得的人前凝血酶-2进行激活处理，从而形成人凝血酶。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在分离或纯化步骤中包括：将人前凝血酶-2经过阴离子柱和疏水柱进行纯化后，再用重组ecarin蛋白激活。

9.如权利要求1所述的融合蛋白或权利要求3所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制备人凝血酶。

10.一种表达和生产重组人凝血酶的序列和方法，其特征在于，包括步骤：

①将含有人蛋白C的信号肽序列与Gla结构域缺失的人凝血酶基因融合，形成表达融合蛋白(人蛋白C-凝血酶2融合蛋白，pc-PT2)的编码基因；

②将上述编码基因插入包含有效的启动子(CMV promotor)、牛生长因子polyA  (bovine growth factor hormone polyA)、鸡beta-肌动蛋白启动子、DHFR基因、SV40  polyA信号序列的表达载体pGN的多克隆位点，形成重组的表达载体； 

③将重组表达载体转染动物细胞，并选出表达所述融合蛋白的宿主细胞；

④培养上一步骤中获得的宿主细胞，从而表达人前凝血酶-2；和

⑤ 分离纯化所述的人前凝血酶-2；和

⑥ 激活人前凝血酶-2，从而获得人凝血酶。