[发明专利]一种重组人凝血酶在动物细胞内的高效表达和生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地涉及一种重组人凝血酶在动物细胞内的高效表达和生产方法。

背景技术

凝血酶是机体凝血系统中的关键酶，生成于损伤处血管内皮细胞，参与凝血过程各个反应环节。凝血酶是由凝血酶原活化变成的一种专一性很强的丝氨酸蛋白类水解酶，由308个氨基酸残基组成，分子质量为36KD。凝血酶是一种双链分子含有A链和B链，两链间由二硫键连接。其中A链含49个氨基酸残基，又称轻链；B链由259个氨基酸残基组成，又称重链(Raimondo De Cristofaro et a1. A natural prothrombin mutant reveals an unexpected influence of the A-chain’s structure on the activity of human α-thrombin. J Biol Chem. 2004, 279(13): l3035- l3043.)。

在人体凝血反应过程中，凝血酶直接作用于纤维蛋白原使其转化为纤维状的不溶性纤维蛋白，网住外渗的血细胞，最终形成血液凝块而完成止血过程。

由于凝血酶所具有的止血快、无副作用的优点，在临床上应用广泛，常以干粉或溶液局部涂于伤口及手术处，控制毛细血管血液渗出。近年来其应用范围正日渐扩大，由单纯的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位出血止血，亦可作为多种外用止血药物的重要原料。

传统的工业生产凝血酶的技术已趋成熟，主要是从动物血浆中及人血浆中制备凝血酶原，再经激活物激活而成为凝血酶。但是，这种生产工艺受到血液资源的限制，随着市场需求的增大，已经远远不能满足需求。由于血浆中往往含有大量的病原体和病毒，如牛海绵状脑炎物质、人肝炎病毒和人类免疫缺陷性病毒等，难免会在终产品中产生残留，增加患者感染的几率。不仅如此，产自动物的凝血酶会引起抗体的产生，这些抗体可与人血液发生交叉反应，且往往诱导严重的出血并发症。

随着基因工程技术的成熟和发展，利用重组方法大量生产的凝血酶已经成为可能，并且能够克服传统工业生产凝血酶的缺点，具有纯度高、防污染、可量产等优点。有研究表明，采用原核细胞如大肠杆菌作为表达载体，产生的凝血酶往往形成不可溶的包涵体，很难复性和纯化，收率低(K. Soejima, N et a1. An efficient refolding method for the preparation of recombinant human prethrombin-2 and characterization of the recombinant derived alpha-thrombin. J Biol Chem, 200, l 0(2): 269-277.)。更重要的是原核生物不能对蛋白质进行如糖基化、羧基化等的翻译后修饰，而凝血酶活性的发挥恰恰需要这些修饰作用。

由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，直接被分泌到胞外，不存在形成包涵体的问题，而且在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。在很多工业生产中，细胞培养过程中不添加动物源性的营养物质，所有成分都已知、可控，避免了病原体或者病毒的残留。高密度培养工艺是重组蛋白和单克隆抗体等生物技术产品规模化工业生产中的主流工艺技术，具有高细胞密度，高产量，高效率，产品质量可控，和容易实现工艺放大等优点。

美国FDA于2008年1月批准了Zymogenetics公司的重组人凝血酶Recothrom上市，Recothrom是第一个被批准上市的无血浆的重组凝血酶，由带有凝血酶表达载体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞大规模培养后分泌至培养基中，经过高度纯化制成，后者是通过基因修饰用来生产人凝血酶的细胞系。这些细胞不带有任何已知的病原体，并且产品经过了病毒灭活的程序。基于一项411例病人参加的Ⅲ期临床研究结果表明，该产品与牛凝血酶有同等的功效，却显著减少抗体产生几率(Chapman WC et a1. A phase 3, randomized, double-blind comparative study of the efficacy and safety of topical recombinant human thrombin and bovine thrombin in surgical hemostasis. J Am Coll Surg, 2007, 205(2): 256-265.)。

然而，采用CHO细胞进行表达时，其表达效率较低，导致生产成本上升等不利因素。