[发明专利]一种重楼属植物细胞的Giemsa-C带染色方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体为一种重楼属植物细胞的Giemsa-C带染色方法。

背景技术

重楼属（Paris）为黑药花科（Melanthiaceae）重楼组（Parideae），该属植物为我国传统中药材，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊功效，用于治疗痈疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、惊风抽搐等症。近年来被广泛用于中成药和新药的制作。随着药物工业化生产的发展，该属植物需求量大，但其药用部位生长周期长，自然繁殖率低，生长缓慢，导致民间滥挖严重，野生资源面临枯竭，尤其是有些还未深入研究的种濒临灭绝。因此，对重楼属植物资源可持续利用和种质资源多样性保护研究迫在眉睫。

重楼属植物在全世界有24种，中国分布的有22种。种间形态差异小，不同居群在某些形态性状上存在较大变异，且不同居群间形态性状的进化速度常不同步，故很难对该属进行系统研究和属下分类单位进行鉴别，不利于该属种质资源多样性保护和资源可持续利用研究。

Giemsa-C带主要显示染色体上由重复DNA序列组成的异染色质，由于C带带型在同一物种内具有相对稳定性，而在种间具有丰富的多态性，因而可以作为物种鉴别的一种技术手段。

Giemsa-C带染色方法原理是，染色体经比较温和的碱或酸变性处理后，DNA双链解开，再在盐溶液中温育复性。复性时具有重复DNA序列组成的异染色质较常染色质复性速度快，可以优先与Giemsa染料结合，染色较深，而常染色质则着色较浅，从而在整条染色体上形成深浅不一的带纹。Giemsa-C带染色方法主要显示着丝粒、端粒、核仁组成区域或染色体臂上某些部位的重复DNA序列组成的异染色质，该法广泛用于动物细胞分析。近年来，该方法在植物细胞分析方面得到了较大的发展。目前常用的方法为HSG(Hydrochloride-Saline-Giemsa)、BSG（Barium-Saline-Giemsa）和HBSG（Hydrochloride-Barium-Saline-

Giemsa）。HSG法是采用盐酸变性，盐复性，Giemsa染液染色；BSG法是采用氢氧化钡变性，盐复性，Giemsa染液染色；HBSG法是采用盐酸预变性再用氢氧化钡变性，盐复性，Giemsa染液染色。HSG法盐酸变性处理时间和温度不便掌握，易导致染色浅或无带。BSG法由于氢氧化钡和空气中二氧化碳易生成碳酸钡沉淀使载片污染。HBSG法是HSG和BSG的改良方法，常用于禾本科等中小型染色体的植物。

重楼属植物染色体为大型染色体，其染色体较长。经过对现有大型染色体Giemsa-C带染色方法检索发现，张洪达等采用HSG法对洋葱染色体C带显带重复性和成功率进行了研究，其预处理药品为秋水仙素，易使科研人员受药品伤害；去壁低渗法制片，带纹影响因素较多；盐酸处理温度和时间不便于掌握，易使显带不充分，带纹模糊[河北大学学报，第10卷，第3期，65—69页（1990）]。梁顺祥和许永财采用BSG法对蚕豆Giemsa-C带进行了分析，该方法预处理药物同样为秋水仙素。实验操作过程中氢氧化钡和空气中二氧化碳反应生成的碳酸钡沉淀易附着于染色体上使分析困难[青海农林科技，第1期，62—64页（1995）]。胡凤荣等采用改良HBSG法对药百合根尖进行了Giemsa-C带分析，实验操作过程中盐酸处理温度和时间不易控制，使带纹模糊；碳酸钡沉淀易附着于染色体上，使分析困难；磷酸缓冲液pH易发生改变，造成染色颜色不稳定[南京林业大学学报，第33卷，第3期，17—19页（2009）]。

采用以上针对大型染色体的Giemsa-C带染色方法，对重楼属植物Giemsa-C带进行研究发现，易出现染色体缠绕、带纹模糊、制片污染严重等问题。因此，需要一种操作简便、染色体分散、带纹清晰、制片洁净的Giemsa-C带染色方法，以满足重楼属植物种质资源鉴定和杂交育种早期鉴定研究快速发展。

本发明采用的一种重楼属植物细胞的Giemsa-C带染色方法，是在大型染色体植物Giemsa-C带常用的几种染色方法的基础上，通过改变反应条件，如预处理方式、制片方法、空气干燥时间、变性时间和方式、复性时间和方式以及染液浓度和染色时间等达到染色体分散良好，C带带纹丰富清晰。建立了适宜于重楼属植物的Giemsa-C带染色方法，为重楼属植物进行种质资源鉴定和杂交育种早期鉴定提供有效的分析方法。

发明内容

本发明的具体技术方案如下：

一种重楼属植物细胞的Giemsa-C带染色方法包括以下步骤：