[发明专利]一种胰岛冻存保护剂及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种胰岛冻存保护剂及其使用方法。

背景技术

糖尿病严重影响人们的身体健康，糖尿病分为I型和II型两种。I型糖尿病是胰岛素依赖型，大约10％的糖尿病患者为I型糖尿病。约30％的II型糖尿病患者至中、晚期（病程20年以上）也会发展成为胰岛素依赖型。注射胰岛素是目前控制糖尿病患者血糖的有效手段，但外源性胰岛素不能达到生理性调节血糖的目的，因此不能制止糖尿病并发症如肾病、神经系统疾病、视网膜病变以及心血管病等的发生和发展，从而大大降低患者生活质量，最终导致死亡。

有研究发现胰岛细胞移植的患者比注射胰岛素的患者糖尿病和视网膜病变的发生率下降，出现时间延迟，尤其是在移植后的前6年差别更为显著。这说明胰岛细胞移植可以使糖尿病慢性并发症延缓6年以上。这对于提高糖尿病患者的生活质量非常重要。因此，胰岛细胞移植治疗糖尿病如同肾移植治疗终末期肾功能衰竭一样，将成为糖尿病的最有效治疗手段。2000年Edmonton治疗方案的成功，推动了世界成人胰岛细胞移植治疗1型糖尿病的迅速发展。在胰岛细胞移植的实施过程中,最关键的就是获得足够量的胰岛细胞。然而胰岛细胞分离纯化是一个复杂的、技术性强的过程，往往需要2个以上供体胰腺才够满足一个病人的使用。要同时满足2个以上血型相符的供体才能进行该移植，使得胰岛细胞的保存显得尤为重要，甚至影响到胰岛细胞移植技术的实际应用及推广。

常规的细胞冻存保存剂为DMSO10%+FBS10-20%+细胞培养液（主要有DMEM,PRIM1640等），它主要是适用于单细胞悬液的冻存保护剂。但胰岛细胞不同于普通的细胞，它是由β、α、γ、θ等细胞组成的细胞团，共同发挥调节血糖水平的作用。用常规单细胞悬液的冻存保护剂及其冻存方法并不能有效的保护胰岛细胞团。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种用于有效地保存分离获得的胰岛细胞，避免其受冷冻损伤，以供临床应用的胰岛冻存保护剂及其使用方法。

本发明的胰岛冻存保护剂，包括A液、B液、C液和D液，组成如下：

A液为基础冻存培养基，组成为M-199培养基50%～70%, AB血清30%～50%，1M Hepes 1～3%，乌司他丁100～200IU/ml；B液为2M DMSO冻存培养基，含DMSO14.2%，基础冻存培养基85.8%；C液为3M DMSO冻存培养基，含DMSO 21.3%，基础冻存培养基78.7%；D液为异丙醇；上述百分比均表示体积百分比。

所述的胰岛冻存保护剂的使用方法，具体步骤如下：

1)        胰岛细胞的准备：按常规方法分离胰岛细胞；

2)        将胰岛细胞装入离心管中，在280×g的离心力下离心1分钟；

3)        吸弃上清液；

4)        在离心管内加入10~20ml的A液，在280×g的离心力下离心1分钟，吸弃上清，再加入A液10~15ml重悬细胞，转移入细胞冻存袋；

5)        在细胞冻存袋中加入B液5~10ml；

6)        室温下预孵育细胞3~5分钟；

7)        再次加入5~10ml B液；

8)        室温下孵育5~10分钟；

9)        加入20~30ml C液，室温下孵育5~10分钟；

10)    将细胞冻存袋置于D液中，放入4℃冰箱5~15分钟；

11)    将细胞冻存袋移出4℃冰箱，连同D液一起放入-80℃超低温冰箱中12～16小时；

12)    取出细胞冻存袋，将细胞冻存袋置入液氮中长期保存。

本发明的显著优点：

1）在冻存保护剂中添加高浓度AB血清，替代胎牛血清，可用于临床治疗应用，同时可以抑制消化胰岛时残留的消化酶作用。

2）加入的乌司他丁是一种蛋白酶抑制剂，可以抑制残留的胰蛋白酶对胰岛的降解作用。

3）加入的Hepes是一种缓冲体系，可以提供一个稳定的pH缓冲环境。

4）本发明冻存保护剂的使用方法主要是通过用高浓度血清的基础培养基重悬胰岛，然后逐步递增式的加入不同浓度的DMSO冻存液，使DMSO渗透到胰岛细胞团内。并用异丙醇做冻存介质，起到缓慢降温的作用。

附图说明

图1为使用本发明的胰岛冻存保护剂冻存的胰岛复苏AO/PI活性染色，荧光显微镜下：活性胰岛发绿色荧光(白色箭头所示),红色为凋亡胰岛（黑色箭头所示）。