[发明专利]一种粘膜佐剂及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种粘膜佐剂及其制备和应用，特别是一种壳寡糖递送系统组装的粘膜佐剂及其制备和应用。

背景技术

当前导致难以攻克的严重感染性疾病的病原体如人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、结核分枝杆菌等均通过粘膜表面(生殖道、呼吸道、胃肠道)入侵和感染机体，由于机体不能诱导有效的粘膜免疫应答，不能在感染第一时间和地点清除粘膜感染病原体，使病原体迅速扩散入血、进而侵犯全身，造成机体损伤；同时发展为慢性感染，导致严重疾病。

对于经粘膜感染病原体，如能诱导粘膜局部(呼吸道、胃肠道、生殖道)的特异性粘膜免疫应答，特别是sIgA的分泌，则可能在感染初期有效中和病毒或细菌，避免病原体入血而后感染全身器官，从而阻止严重疾病如病毒性心肌炎和慢性结核的发生。因此急需可诱导粘膜sIgA分泌的粘膜疫苗的研制。

已知常规疫苗如灭活、减毒疫苗、蛋白疫苗、DNA疫苗等等经常规途径(肌肉注射、皮下)免疫等通常不能诱导特异性粘膜免疫。无论疫苗的形式，通常靶抗原需要经粘膜部位接种，才能被粘膜APC摄取提呈，激活粘膜相关免疫系统(Mucus-associated lympho tissue，MALT)，诱导粘膜免疫。

然而，粘膜部位接种抗原通常很难诱导免疫应答，由于粘膜局部纤毛的频繁摆动、水解酶、DNA酶的大量存在，使得外来抗原迅速降解，不足以被粘膜APC提呈。因此需要通过粘膜递送系统来对疫苗进行组装，而后行粘膜免疫。

针对抗粘膜感染病原体粘膜疫苗研制的重要性，以及粘膜免疫的技术难点，粘膜疫苗首先必需安全和有效的粘膜递送系统，来递送靶抗原疫苗(如基因疫苗)。该系统应当满足：安全无毒性、缓释性、亲粘膜性、通用性；其次必需添加粘膜佐剂，有效增强粘膜免疫的诱导。

柯萨奇病毒性心肌炎主要由B3型柯萨奇病毒(CVB3)感染所致，青壮年发病较高，可导致约50％的人类急慢性心肌炎和25％扩张性心肌病的发生，是一常见、多发的心血管系统疾病。CVB3属于肠道病毒，通过胃肠道入侵机体后，由于肠道sIgA不能在感染早期及时清除病毒，使病毒迅速扩散入血、进而侵犯心脏和胰腺等器官，导致病毒性心肌炎和胰腺炎；CVB3的持续性感染还可能导致致死性扩张性心肌病的发生，危害严重。目前尚无有效的柯萨奇病毒性心肌炎预防和治疗疫苗问世。

我们前期的研究制备了一种病毒性心肌炎基因疫苗pcDNA3.1-VP1(pVP1)，编码CVB3主要结构抗原VP1(852bp)，该疫苗经肌注免疫，可有效诱导全身性的(脾脏和淋巴结)的特异性T细胞应答和血清IgG分泌，具有中等的免疫保护效果。直接将该基因疫苗进行滴鼻免疫，发现仅能诱导较弱的粘膜免疫(肠道sIgA)，原因与基因在粘膜局部很容易被降解，有效表达的抗原量过低有关。因此我们前期研究以天然生物多糖-脱乙酰壳聚糖(chitosan)为粘膜递送载体介质，以特殊的壳聚糖溶液经与特定浓度的基因疫苗DNA，经共价复合，获得chitosan-pVP1病毒性心肌炎粘膜基因疫苗。该申请已被授予国家发明专利(专利授权号：ZL200710171416.X)。以该粘膜基因疫苗为研究出发点，为了更好地诱导特异性粘膜免疫，延长抗原在粘膜局部的潴留时间、增强粘膜局部对抗原的提呈，必须还要使用良好的粘膜佐剂。

淋巴细胞趋化因子(lymphotactin，LTN)是C族趋化因子，由活化的CD8⁺T细胞、NK细胞和表皮内γδT细胞分泌，在维持粘膜完整性和增强粘膜免疫中发挥重要作用。同时对CD8⁺T和NK细胞具有重要的趋化作用，因此对清除病毒感染至关重要。更为重要的是，LTN可激活粘膜及脾脏内CD4⁺T细胞，促使其分泌大量Th1或Th2细胞因子，有效辅助T细胞或B细胞免疫应答。因此LTN通过激活CD4⁺T细胞，可同时促进固有免疫与获得性免疫的诱导，同时又由于共同粘膜免疫系统性质，促进粘膜免疫和全身免疫的诱导。已有研究显示LTN与蛋白质抗原联合鼻内注射后增加sIgA分泌。因此，本发明选择LTN作为粘膜佐剂，利用其趋引T细胞到达疫苗给予粘膜部位、促进CD4+Th应答等性质，来增强特异性粘膜免疫应答的诱导。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种粘膜佐剂及其制备和应用，所述的这种粘膜佐剂配合其他疫苗进行粘膜部位(滴鼻、口服、经生殖道等)免疫，要解决现有技术中由于常规疫苗无法有效诱导粘膜免疫应答的技术问题。