[发明专利]检测慢性乙肝肝纤维化血清N-糖组峰标记的方法及其用途

说明书

技术领域

    本发明属生物医药领域，涉及肝纤维化血清N-糖组峰标记，具体涉及检测慢性乙肝肝纤维化血清N-糖组峰标记的方法及其用途。

背景技术

长期以来，肝穿刺活检一直是明确肝病病因、评价肝脏炎症坏死及纤维化程度的金标准，对预后判断、治疗选择及疗效评估等具有重要临床意义，但创伤性、取样误差、观察者自身及观察者间偏倚等不足给临床应用造成许多不便。目前临床诊疗中迫切需要寻找便捷的非创伤性替代指标。近年来，以血清指标组合建立肝纤维化诊断模型成为世界性的研究热点。在一系列肝纤维化非创伤性诊断模型中，较具代表性的包括采用慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染患者建模的Fibrotest、Forns指数、APRI指数和HepascoreL等。目前针对慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝纤维化诊断模型仍研究较少，主要有上海市肝纤维化课题协作组(SLFG)所提出的Zeng模型M和我国香港的Hui模型。然而上述研究结果在我国慢性HBV感染患者中尚未得到有效验证和临床应用。

目前国内外采用肝活组织检查+病理学诊断结果作为肝纤维化分期诊断的金标准，属于有创伤性的诊断方法，因此其临床应用受局限。研究报道，血清学检测方法渐成为临床非创伤性肝纤维化诊断的有效方法之一，具有较好的应用前景。目前血清肝纤维化诊断峰标记研究方法主要包括：蛋白和多肽组学、糖组学、microRNA芯片等技术。类似蛋白组学，“糖组学”指对糖组的全面分析研究，其对象主要针对糖蛋白。糖蛋白由多肽和糖通过糖肽键连接而成，根据连接方式的不同，可分为N-糖苷键和O-糖苷键等。已知肝细胞是除浆细胞外血清中糖蛋白的主要来源，肝脏还具有清除体内异常糖基化蛋白的功能，因此,肝脏病变可以引起血清糖蛋白谱的变化，但聚糖结构上高度的复杂性等因素给研究带来很多困难。2001年Callewaert等提出了基于DNA测序仪的荧光糖电泳（DSA-FACE）技术，使对样本的N-糖链进行系统而快速的分析成为可能。该技术已被证实可用于肝硬化和肝细胞癌的诊断。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种检测慢性乙型肝炎肝纤维化血清N-糖组峰标记的方法，尤其涉及一种非创伤性检测慢性乙肝肝纤维化血清N-糖组峰标记的方法及其用途。

本发明采用基于DNA测序仪的荧光糖电泳（DSA-FACE）技术检测慢性HBV感染患者的N-糖组图谱，分析其与肝纤维化的相关性并评价其诊断价值；所述的血清N-糖组峰标记，作为一种非创伤性替代指标，能高效预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，对预后判断、治疗选择及疗效评估等具有现实的临床意义。

具体而言，本发明的检测慢性乙肝肝纤维化血清N-糖组峰标记的方法，其特征在于，采用DSA-FACE技术检测慢性HBV感染患者血清样本测得具有峰值的糖组图谱，将峰值量化后，采用内参校正后的数据，获得非创伤性慢性乙型肝炎肝纤维化血清N-糖组峰标记。本发明方法包括下述步骤：

1）采集检测血清样本

入选条件：有乙型肝炎或HBsAg阳性史超过6个月，现HBsAg和(或)HBVDNA仍为阳性者；

以肝活检病理学诊断明确纤维化程度，其中，S0、S1期列为早期纤维化组，S3、S4期列为晚期纤维化组；

2）寡糖的释放：

2μl血清加入含有2μl缓冲液（10mmol/L NH4HCO3）和3μl水的PCR反应管中，95℃加热5min后4℃放置15min，加入3μl PNGase F（2.2U/μl，pH8.3，3.33% NP40）37℃孵育3h，4℃冷浴后加入100μl水，标记为D管；

3）寡糖的标记：

从D管吸取6μl溶液加入一新的PCR管中，开盖60℃ 烘干60min，加入2μl标记溶液（20mmol/L的APTS与1mol/L 的NaBH3CN之比为1:1），37℃孵育16h，加200μl水终止反应，标记为L管；

4）去唾液酸：

从Ｌ管取2μl溶液加入一新的ＰＣＲ管中，加入3μl 0.25mU去唾液酸酶在37℃孵育过夜，加160μl水振荡混匀，标记为DE管；

5）片段分析：

取DE管10μl溶液用ABI3130测序仪进行片段分析，数据经GeneScan软件分析。

6）将测得的具有峰值的糖组图谱峰值量化，采用内参校正后的数据，获得慢性乙肝肝纤维化血清N-糖组峰标记。