[发明专利]登革病毒样颗粒及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体内容为应用毕赤酵母制备登革病毒样颗粒的方法及应用。

背景技术

登革病毒（dengue virus, DENV）以伊蚊为传播媒介，感染人可引起登革热（dengue fever, DF）、登革出血热（dengue hemorrhagic fever, DHF）和登革休克症（dengue shock syndrome, DSS）。DHF/DSS 病情严重，病死率高，其发病机制至今尚未阐明。由于缺乏有效的登革病毒疫苗，加上控制蚊媒的实际困难，使登革病毒感染流行的地域和流行强度在不断地扩大。目前登革热在全球许多地方卷土重来，已成为世界上分布最广、发病最多、危害较大的一种虫媒病毒性疾病。因此，加强DENV 致病机制、疫苗的研究及快速诊断试剂盒的研制已经成为十分迫切的问题。

登革疫苗的研究已经有近百年的历史，但目前还尚无成功的疫苗问世。制约登革疫苗研究的因素主要有以下几个方面：(1) 缺乏合适的、能模拟人体感染DENV临床症状的动物模型；(2) 对DENV感染导致DHF和DSS的具体机制尚不清楚；(3) DENV不同型之间存在抗体依赖的感染增强作用（antibody-dependent enhancement, ADE）。因此研制DENV疫苗需要对4个型都有均衡的保护作用，因此增加了研制的难度。

病毒样颗粒（Virus-like particles, VLPs) 疫苗的出现为研发新型安全高效的疫苗提供了一个新的契机。VLPs是指由病毒的一个或多个结构蛋白组装成的，不含病毒核酸，不能进行自主复制的空心颗粒。由于VLPs不包含病毒DNA或RNA，因此不存在毒力的回复和同源重组的隐患。同时，VLPs保留了与天然病毒粒子相同或类似的空间构型和诱导中和抗体的抗原表位，具有很强的免疫原性。不但能诱导产生体液免疫，而且可以激发CD4⁺T细胞的增殖和CTL反应（cytotoxic T lymphocyte）。目前多数病毒的VLPs是通过体外表达系统来实现有效的自我组装，其中包括HIV, Influenza A virus, Hantaan virus, Rotavirus, Papillomavirus 等病毒。

登革病毒为黄病毒科黄病毒属的成员，为单股正链RNA病毒，基因组长约11kb，含有一条单一的开放读码框。基因排列顺序为5'-NCR-C- PrM/M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-NCR-3'，共编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。其中E基因编码的E蛋白为病毒表面包膜糖蛋白，具有与细胞表面受体结合，介导膜融合，诱导产生中和抗体等多种生物学功能，是病毒最重要的抗原成份。PrM基因编码的PrM/M蛋白也被认为是诱导产生中和抗体的抗原成分。非结构基因及非编码区主要与病毒复制及蛋白翻译有关。有报道称，黄病毒的包膜E蛋白与prM蛋白在体外表达系统中共表达时，可折叠为类似天然病毒粒子空间结构的多聚体颗粒即病毒样颗粒，也称作亚病毒颗粒（subviral particles，SVPs）。在登革病毒方面，有研究者应用酵母系统、CHO-K1细胞等进行了VLPs表达的尝试，但DENV VLPs在哺乳动物细胞中的低水平表达以及蛋白功能的维护一直是阻碍登革VLPs疫苗发展的瓶颈。因此，选择合适的DENV VLPs表达系统，并采取合理的策略提高VLPs表达产量和分泌水平成为了发展DENV VLPs疫苗急需解决的问题。目前，相关研究中尚未发现有在毕赤酵母真核系统中分泌表达四个型登革病毒病毒样颗粒研究的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供登革病毒1-4病毒样颗粒。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先构建用于不同重组表达子所采用的引物序列，分别可扩增登革病毒SprME基因，其长度为1983 bp，编码prM信号肽，prM蛋白和全长的E蛋白。又可扩增到的是SprME472基因，其长度为1914 bp，编码prM信号肽，prM蛋白和TM2端截断的E蛋白。