[发明专利]一种人血管eNOS基因启动子改构体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种人血管eNOS基因启动子改构体及其制备方法和应用。

背景技术

人血管内皮一氧化氮合酶（eNOS）不仅参与了血压调整、血管通透性调节、防止白细胞粘附和血小板聚集等生理过程，而且涉及高血压、动脉粥样硬化性心脏病、血管狭窄和阻塞、缺血性脑卒中等诸多严重病理过程的发生和发展。eNOS基因在心血管内皮细胞中固有表达，越来越多的研究证明eNOS在有害因素存在下对维持血压自稳和血管完整性及张力必不可少，eNOS的表达异常在高血压、动脉粥样硬化、血管功能障碍相关性疾病的发生和发展中至关重要。目前有关人血管eNOS基因的研究主要聚焦于：上调或下调eNOS活性的刺激因素，eNOS基因启动子中顺式调控元件的功能，eNOS基因多态性及eNOS基因表达的信号调控通路。

传统认为eNOS基因主要对血管壁切应力刺激应答，之后发现很多刺激因素都能明显改变eNOS基因的表达，如缺氧、溶血磷脂酰胆碱、 塞利洛尔、黄酮类化合物、非诺贝特、神经酰胺和氧化低密度脂蛋白等。尽管发现影响人血管eNOS基因表达的因素越来越多，但目前对它们如何上调或下调eNOS基因的表达却知之甚少。

关于eNOS基因的多态性与相关疾病的潜在联系，有文献表明G894→T多态性可导致所编码的氨基酸的Glu298Asp多态性, Glu298Asp的错义导致eNOS在此处的构象发生改变, 由α-螺旋变为紧密折叠, 由此推测此突变可能影响eNOS蛋白的功能, 使NO生成减少, 导致血小板聚集性增强, 白细胞向内皮黏附, 平滑肌细胞增生等病理生理现象。

有关eNOS基因表达的信号调控通路，新发现激活丝裂原活化蛋白激酶家族成员细胞外信号调节激酶ERK1/2信号通路可显著上调eNOS基因的转录活性。另一些刺激因素如溶血磷脂酰胆碱也可以通过激活c-jun氮末端激酶JNK信号通路上调eNOS基因的转录活性，而丝裂原活化蛋白激酶p38信号通路的活化则显著下调其活性，这种作用可被靶向siRNA沉默p38α基因而取消。

SeiichiroWariishi等(1995)研究eNOS基因启动子顺式调控元件的功能，发现SP1元件对转录活性起关键作用。SP1结合位点同时受到位于上游-203位点的GATA位点的调节，当GATA位点发生突变时，eNOS基因启动子的活性只是略微下降，但当SP1位点突变时会导致启动子活性急剧下降，提示GATA顺式调控元件只有在SP1位点完整时才能发挥作用。William C.Sessa等利用PCR点突变方法发现SP1和TATA元件决定了eNOS启动子的基础转录活性，并得到FotulaKarantzoulis-Fegaras等和KatarzynaCieslik等的进一步证实。

人血管eNOS基因在心血管内皮细胞中固有表达，在维持血管张力中起着重要作用，其低表达与血管功能障碍相关性疾病密切关联。可是，已知eNOS基因启动子结构本身缺乏核心启动子识别序列，即传统的TATA BOX和起始子，而依赖GC BOX结合SP1转录因子协助转录调控，导致无论其基础活性还是刺激活性都处于低水平，明显增加了探明其功能的难度，也使得其基因治疗难以推进。因此，基于上述发现SP1是维持eNOS基因启动子活性关键的理论，我们探索了在eNOS基因启动子合适位点插入关键调控元件以改造eNOS基因启动子结构从而从源头提高eNOS基因启动子活性的方法。迄今为止，国内外尚未见任何通过改造eNOS基因启动子的结构而增加其活性的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的人血管eNOS基因启动子存在的活性较低等问题，提供一种基础活性和刺激活性均明显提高的人血管eNOS基因启动子改构体。

本发明目的通过以下技术方案予以实现：

本发明利用PCR插入序列突变技术为人eNOS基因启动子添加一个调控元件SP1的通用识别序列，以此来改造启动子结构，目的在于提高启动子的转录活性；通过氯化钴构建的HUVEC-12细胞缺氧模型和双荧光报告系统完成启动子改构体的转染和检测，分析启动子及其改构体的转录活性变化，初步验证了改构体的功能（图1）。

具体地，本发明包括如下技术方案：

一种人血管eNOS基因启动子改构体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所述人血管eNOS基因启动子改构体的制备方法包括如下步骤：

（1）根据eNOS基因启动子序列设计一对5’端相连方向相反的引物，所述eNOS基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述引物序列如SEQ ID NO:3~4所示；