[发明专利]人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法

权利要求书

1.一种人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）细胞与病毒培养：将HEp-2细胞或Vero细胞培养于含有血清的DMEM培养基中，待细胞丰度为80%~90%时，接种人呼吸道合胞病毒，然后更换含血清的DMEM培养基继续培养细胞，细胞出现完全病变后收集细胞及培养基，离心，收集上清作为病毒贮液；

（2）病毒的浓缩与纯化：所述病毒贮液利用聚乙二醇沉淀法进行浓缩，然后通过蔗糖密度梯度离心进一步纯化，得到病毒混悬液；

（3）病毒的裂解：向所述病毒混悬液中加入病毒裂解液，4℃裂解20~30min，然后加入缓冲液A稀释3~5倍，离心，取上清，得到病毒蛋白粗提液；

其中，所述病毒混悬液与病毒裂解液的体积比为1:5~1:10，所述病毒裂解液为含有250 mM 蔗糖，25 mM MES-NaOH，10 mM NaCl，0.5% Triton X-100，2mM EDTA，1 mM PMSF，pH 5.7的溶液；所述缓冲液A为含有25 mM MES-NaOH，0.03% Triton X-100和10 mM NaCl，pH 5.7的溶液；

（4）离子交换柱层析纯化：采用阴离子交换层析柱，先用缓冲液A平衡柱子，之后上样病毒蛋白粗提溶液，经2倍柱体积缓冲液A清洗后，采用缓冲液A和缓冲液B混合缓冲液，进行线性梯度洗脱，梯度洗脱过程中，混合缓冲液中缓冲液B的含量从0线性递增至100%，洗脱5~15个柱体积，收集穿透峰和各洗脱峰，进行SDS-PAGE和Western Blot分析检测，得到阳性洗脱组分，

其中所述缓冲液B为含有25 mM MES-NaOH，0.03% Triton X-100，1M NaCl，pH 5.7的溶液；

（5）凝胶过滤柱层析纯化：采用凝胶过滤层析柱，先用缓冲液C平衡柱子，上样经离子交换层析柱得到的阳性洗脱组分，然后用缓冲液C洗脱，收集各洗脱峰，进行SDS-PAGE和Western Blot分析检测，得到阳性洗脱液，然后将该洗脱液冻干，即得；

其中，所述缓冲液C为含有25 mM MES-NaOH，0.03% Triton X-100，150 mM NaCl，pH 5.7的溶液。

2.根据权利要求1所述的人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤（1）中，接种人呼吸道合胞病毒的量为MOI=0.005~0.20。

3.根据权利要求1所述的人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤（2）中，所述病毒浓缩的具体方法为：向所述病毒贮液中加入MgSO₄溶液和pH7.0~8.0的HEPES溶液，至该混合溶液中MgSO₄的终浓度为0.1~0.2 M，HEPES的终浓度为50~100mM，然后用50% PEG6000滴加入到该混合溶液中，滴加至PEG6000的体积百分含量为10%时停止滴加，在4℃搅拌90 min，然后在5800-6000rpm条件下，离心20 min，弃上清，按沉淀量的1~5%的量加预冷NTE溶液溶解，并且向该溶液中加入MgSO₄溶液和EDTA溶液，至该溶液中所述MgSO₄的终浓度为0.1~0.2M，EDTA的终浓度为1~2mM，得到溶解的病毒液；

其中，所述NTE溶液为含有150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5的溶液。

4.根据权利要求1所述的人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤（2）中，所述病毒纯化的具体方法为：依次将2mL 60%、2mL 45%及2mL 30%蔗糖溶液由下至上放入离心管中，所述溶解的病毒液置于最上层，35000rpm，4℃离心90min，收集病毒带，然后用NTE溶液稀释3~5倍后，22000rpm，4℃离心90min，收集沉淀，用NTE溶液溶解后，得到病毒混悬液；

其中，所述NTE溶液为含有150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5的溶液。

5.根据权利要求1所述的人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤（4）中，所述阴离子交换层析柱为Hitrap Q FF、Hitrap Q HP、Hitrap DEAE FF。

6.根据权利要求1所述的人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤（5）中，所述凝胶过滤层析柱的填料为Sephacryl S-300，Sephacryl S-400，Sepharose 6B， Sepharose CL-6B，Superdex 200，Superose 6。