[发明专利]人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒学、生物技术领域，具体涉及一种人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法。

背景技术

人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus, RSV）是全球范围内引起婴幼儿下呼吸道感染，特别是毛细支气管炎最重要的病毒性病原。婴幼儿发病高峰期为出生后6周至6个月，尤其是2~6个月内发病率高，出生一年内约有50%婴儿感染RSV。RSV感染患儿的死亡率约为1%，伴有发育不良、慢性肺部疾患和先天性心脏病等疾病的儿童死亡率则更高。近年来，RSV感染在我国的流行发病率为0.24%~21.9%，住院病死率为0.5%~4%；同时老人和免疫缺陷病人也易遭受RSV引起的严重感染，且有感染史者易发生肺功能异常、支气管哮喘等肺部疾患。世界卫生组织估计全球每年发病和死亡人数分别为6400万和16万，且近期有研究认为RSV感染引起的社会经济负担实际上比季节性流感更加严重，因此，RSV感染已成为当前迫切需要研究的重要课题。

迄今为止，对RSV的感染仍然缺乏有效的特异性治疗方法，尚无安全、有效的疫苗批准上市，临床上使用的抗病毒药物如利巴韦林（Ribavirin）治疗RSV感染也未取得理想的疗效，且成本很高，因此研发具有治疗作用的RSV特异性单克隆抗体（Monoclonal antibody, McAb）和疫苗具有重要现实意义。目前，WHO已将RSV疫苗列为全球疫苗计划中优先发展的疫苗之一，而其中以RSV主要中和抗原为基础的亚单位疫苗以其安全性好、能诱导机体产生较好的血清抗体而备受瞩目。当前，DNA疫苗和亚单位疫苗等异源性初免/加强（prime-boost）免疫策略或者亚单位疫苗与Toll-like 受体（Toll-like receptor, TLR）激动剂联合应用的免疫策略是当今新型病毒疫苗研究的主要趋势，有望进一步提高亚单位的免疫原性和安全性，但难点在于制备免疫原性好、纯度高的RSV中和抗原。

RSV是副粘病毒科肺病毒属，中等大小（120~300 nm），有包膜，为非节段单股负链RNA病毒，约15222个核苷酸，编码11种蛋白，其中3种跨膜蛋白（G、F和SH），4种核壳体蛋白（N、P、L和M2~1），2种非结构蛋白（NS1和NS2），1种基质蛋白（M）和1种RNA调节因子（M2~2）。RSV中和抗原主要包括RSV膜表面融合蛋白(Fusion protein F)和黏附蛋白（Attachment protein G）两种糖蛋白，F与G蛋白为引起免疫反应的主要抗原，都可使机体产生中和抗体，疫苗及单克隆抗体的靶标多选择在这两个蛋白。F蛋白直接介导病毒与细胞的融合、病毒的穿入、合胞体的形成，与G蛋白相比，其蛋白基因变异小，在不同的亚型间具有高度的抗原同源性，是主要的交叉保护性抗原，被认为是很有潜力的亚单位候选疫苗，但其瓶颈问题是F蛋白的制备和纯化方法。

F蛋白作为膜蛋白的一种，其制备存在着含量低、低产量、丢失活性及需要大量优化纯化过程等诸多困难。在F蛋白的纯化方面，当前常用的方法是利用免疫亲和层析和蛋白电泳法等纯化方法，但这些方法不仅蛋白产量少且会导致其抗原性的部分丧失，由此可见，为加快RSV新型疫苗的研制，迫切需要建立F蛋白制备和纯化的新方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法。该方法基于同一种缓冲体系，经过两步层析纯化获得高抗原性的F蛋白，并且该方法纯化人呼吸道合胞病毒F蛋白的产率较高。

为解决上述技术问题，本发明所采用技术方案是：

一种人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法，该方法包括以下步骤：

（1）细胞与病毒培养：将HEp-2细胞或Vero细胞培养于含有血清的DMEM培养基中，待细胞丰度为80%~90%时，接种人呼吸道合胞病毒，然后更换含血清的DMEM培养基继续培养细胞，细胞出现完全病变后收集细胞及培养基，离心，收集上清作为病毒贮液；

（2）病毒的浓缩与纯化：所述病毒贮液利用聚乙二醇沉淀法进行浓缩，然后通过蔗糖密度梯度离心进一步纯化，得到病毒混悬液；

（3）病毒的裂解：向所述病毒混悬液中加入病毒裂解液，4℃裂解20-30min，然后加入缓冲液A稀释3~5倍，离心，取上清，得到病毒蛋白粗提液；