[发明专利]一种电化学免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及电化学免疫领域，特别涉及一种基于纳米铂壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学免疫检测方法。

背景技术

原发性肝癌(primary carcinoma of the liver)是我国常见恶性肿瘤之一。死亡率高，在恶性肿瘤致死率中仅次于胃癌、食道癌居第三位，在部份地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌。我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。因此，对原发性肝癌进行早期诊断、制定合理治疗方案及评估疗效尤为重要。目前用于原发性肝癌辅助诊断的主要方法有胸片、CT、以及痰细胞学检查等，而血清肿瘤标志物的检测由于取样简单、易于接受等特点，在肿瘤筛查、诊断、评价治疗疗效等方面具有较大的实用价值。

血清甲胎蛋白(AFP)是胚胎时期肝细胞合成的一种特殊的糖蛋白，胎儿血清中含量较高，出生1～2周后含量已不易测到，故正常成人血清中用一般方法测不到甲胎蛋白(AFP)。因此，甲胎蛋白(AFP)可以作为原发性肝癌血清学诊断的指标。但部分患者会检出假阳性或假阴性，结合新的肿瘤标志物对于提高原发性肝癌的检出率具有重要意义。异常凝血酶原是除甲胎蛋白外公认的有效肝癌标志物，在肝癌的诊断、预后和疗效监测上都有一定价值。凝血酶原是由肝脏合成的依赖维生素K的凝血因子，异常凝血酶原(Abnormal Prothrombin，APT)和凝血酶原的化学结构极其相似，区别在于：异常凝血酶原(APT)分子氨基端的特定位置上的谷氨酸残基未经羧基化，因而缺乏结合钙离子的结构基础，在一般凝血试验中无凝血活性。自从1984年Liebman等观察到原发性肝癌患者血浆异常凝血酶原(APT)水平显著升高，异常凝血酶原(APT)与肝癌的关系引起研究者的关注。虽然APT轻度升高亦可见于维生素K缺乏，但在注射维生素K后即可得到纠正，故并不影响对原发性肝癌的诊断。因此，异常凝血酶原(APT)作为原发性肝癌的肿瘤标志物越来越受到重视，尤其在甲胎蛋白(AFP)不升高者或低度升高者体内，异常凝血酶原(APT)往往升高，对这类原发性肝癌病人的诊断更有价值。目前，国内外采用酶联免疫方法测定异常凝血酶原(APT)已处于临床应用阶段。由于酶联免疫法灵敏度不高，不易检测出痕量异常凝血酶原(APT)，影响对原发性肝癌检测的准确性。

电化学发光(ECL)是通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号，进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。电化学发光(ECL)与化学发光(CL)的差异在于，电化学发光(ECL)是电启动发光反应，而化学发光(CL)是通过化合物混合启动发光反应。因此，电化学发光(ECL)反应易精确控制，具有灵活性和稳定性。电化学发光免疫分析(Electro-Chemiluminescence Immunoassay，ECLI)是电化学发光和免疫测定相结合的产物。在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，用标记物标记抗体，通过抗原与抗体的特异性反应，根据电极上发出的光强度对待测的抗原或抗体进行定性、定量分析，兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性。电化学免疫分析的标记物主要有两类：生物酶及电化学活性物质。用作标记物的电化学活性物质为具有电化学氧化还原性质的金属离子和电活性的有机功能基团。

纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1～100nm)或由它们作为基本单元构成的材料，这大约相当于10～100个原子紧密排列在一起的尺度。由于纳米材料具有的高比表面积、高活性、特殊物理性质及小尺寸，使得纳米材料从一个惰性体转变为一个活泼的能提供电子和获取电子的物体，将其引入传感器的构建中可明显增强传感器的响应速度、灵敏度、选择性等。因此，提供一种灵敏度高、特异性好的基于复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法用来检测异常凝血酶原(APT)，对原发性肝癌的早期诊断、病情监测、判断预后及其制定合理的治疗方案和评估疗效具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种基于纳米铂壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学免疫检测方法。该检测方法采用双抗体夹心法，使固载在电极表面的异常凝血酶原抗体与样品溶液中的异常凝血酶原发生免疫反应，再和纳米铂壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与异常凝血酶原抗体共耦合物结合。基于纳米铂壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学活性，测得的循环伏安还原峰峰电流值与异常凝血酶原浓度呈正相关，进而检测检测样品中异常凝血酶原的浓度。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：