[发明专利]可诱导性组织特异性表达载体及其用途

说明书

技术领域

    本发明属生物技术领域，涉及可诱导性组织特异性表达载体及其用途。具体涉及microRNA可诱导性组织特异性表达载体及用途，尤其是一种Cre酶介导的、可诱导的、组织特异的miRNA表达载体pEFG LPAL-MIR，所述载体可用表达microRNA，和建立可诱导性的、组织特异表达转基因试验动物模型。

背景技术

研究报道，microRNA是由21-25个核苷酸组成的小的内源性非编码的单链RNA分子，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生；所述前体在细胞之中被RNaseIII Dicer切割成约22个核苷酸的microRNA双链，其中一条链被降解，另外一条被加工成成熟的microRNA。在动物细胞实验中，microRNA一般通过部分序列同源性于靶基因mRNA的3’-UTR（3’端非编码区）结合，导致翻译阻止，在很少的情况下，导致mRNA的降解。microRNA的发现揭示了一种新的基因调节机制，在发育和细胞分化方面起具有重要的作用和意义。研究揭示，miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，如，早期发育，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡，脂肪代谢以及细胞分化等。有研究发现microRNA与许多疾病的发生有很大的关系，比如肿瘤，心脏病等等，可进一步指导疾病的诊断。由于microRNA存在的广泛性和多样性，并且很多miRNA的表达具有组织以及发育阶段表达的特异性，因此提示microRNA可能有更加广泛多样的生物功能。

目前有关疾病的研究需要可诱导性的、组织特异表达转基因试验动物模型，但迄今为止，尚未见有专门用于构建转基因试验动物模型尤其是转基因试验小鼠的miRNA表达载体，加之普通的CMV启动子很容易在ES细胞中被沉默，这些都为microRNA的研究或者转基因试验动物模型的制备造成了很大的困难。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种可诱导性组织特异性表达载体，具体涉及可诱导的、组织特异的miRNA表达载体，尤其是一种Cre酶介导的、可诱导的、组织特异的miRNA表达载体pEFG LPAL-MIR。所述载体可用于表达microRNA，和建立可诱导性的、组织特异表达转基因试验动物模型。

本发明的进一步目的是提供所述的表达载体在用于表达microRNA，和建立可诱导性的、组织特异表达转基因试验动物模型中的用途。

本发明以内含子方式表达miRNA，所述的载体在不影响标记基因EGFP表达的同时，还能实现miRNA的有效表达；该载体可用于体外实验以及转基因小鼠，所述的Cre酶对该载体的表达具有很好的可诱导性。

本发明的表达载体中，在pEGFP质粒的基础上，加入了EF1 alpha启动子。 

具体而言，本发明的可诱导性组织特异性表达载体，其特征在于，主要包括以下结构：EF1α启动子， EGFP荧光标记基因，两端连有同向LoxP序列的BGH polyA加尾转录终止序列和内部引入酶切位点的内含子序列；所述的载体为pEFG LPAL-MIR，具有序列1的结构。

本发明中，所述载体使用EF1 alpha通用启动子驱动基因表达；EGFP荧光标记基因用于指示基因的表达；然后是两段连有同向LoxP71和LoxP66的BDH polyA加尾转录终止信号，可以被Cre酶诱导；在所述的终止信号其后的是一段内含子序列，表达miRNA前体插入该内含子中；

本发明中，EF1α启动子具有较高水平表达且不容易被沉默；

本发明中， EGFP荧光标记基因便于将来转基因小鼠的鉴定及实时观测转基因的表达；

本发明中， Cre酶可有效介导该两端连有同向LoxP序列的BGH polyA加尾转录终止序列的切除，从而有效控制3’序列的转录与否；

本发明中，对内含子序列进行了改造，引入酶切位点，从而可将miRNA前体插入该位点，实现miRNA前体的有效剪切，并不干扰其前面的EGFP荧光基因表达。