[发明专利]一种检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒、标志物及方法

权利要求书

1.一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒，包括dNTP、10x PCR buffer、MgCl₂、ddH₂O，其特征在于，还包括标准血液DNA、热启动TaqDNA聚合酶、引物F 1、引物B1、引物F 2、引物B2、引物B3、引物R1、引物L1、引物R2、引物L2、引物L3；上述引物用于做甲基化特异性PCR，PCR时，引物的配对方案为：

引物F1、B1配对，引物F1、B2配对，引物F2、B1配对，引物F2、B3配对，用于检测ASS基因(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)甲基化情况；

引物R1、L1配对，引物R1、L2配对，引物R2、L3配对，用于检测ASL基因(GeneBank NG_009288，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)甲基化情况。

2.根据权利要求1所述一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒，其特征在于，所述标准血液DNA为取自无肝癌健康人血液提取的基因组DNA并经过重亚硫酸盐处理。

3.根据权利要求1所述一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒，其特征在于，引物F 1具有序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，引物B1具有序列表中SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，引物F2具有序列表中SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，引物B2具有序列表中SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，引物B3具有序列表中SEQ ID No.10所示的核苷酸序列，引物R1具有序列表中SEQ IDNo.11所示的核苷酸序列，引物L1具有序列表中SEQ ID No.12所示的核苷酸序列，引物R2具有序列表中SEQ ID No.13所示的核苷酸序列，引物L2具有序列表中SEQ ID No.14所示的核苷酸序列，引物L3具有序列表中SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。

4.一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的标志物，其特征在于，所述标志物包括肝癌特异性低调控基因ASS(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)或ASL(GeneBank NG_009288，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)的甲基化的第一外显子和启动子区域；所述ASS(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)基因甲基化的第一外显子和启动子区域核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；所述ASL(GeneBank NG_009288，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)基因的甲基化的第一外显子和启动子区域核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.2所示。

5.检测血液中转移肝癌细胞的标志物，其特征在于，所述标志物包括一个或多个甲基化的CpG岛并由SEQ ID No.3表示。

6.根据权利要求5所述检测血液中转移肝癌细胞的标志物，其特征在于，衍生于肝癌特异性表达降低的基因ASS(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)。

7.检测血液中转移肝癌细胞的标志物，其特征在于，所述标志物包括一个或多个甲基化的CpG岛并由SEQ ID No.4表示。

8.检测血液中转移肝癌细胞的标志物，其特征在于，所述标志物包括一个或多个甲基化的CpG岛并由SEQ ID No.5表示。

9.根据权利要求7-8任何一项所述检测血液中转移肝癌细胞的标志物，其特征在于，衍生于肝癌特异性表达降低的基因ASL(GeneBank NG_009288，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)。

10.一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从血液样品中提取基因组DNA；

(2)将基因组DNA经重亚硫酸盐处理，使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶；

(3)利用权利要求1所述试剂盒及引物配对方案，以ddH₂O、标准血液DNA、经重亚硫酸盐处理的血液样品基因组DNA为模板，进行甲基化特异性PCR反应；

(4)用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，如果以ddH₂O、标准血液DNA为模板的PCR无扩增条带，而以经重亚硫酸盐处理的血液样品基因组DNA为模板的PCR扩增有扩增条带，且扩增条带与预测的条带大小一致，则认为所检测的血液样品中含有转移肝癌细胞。