[发明专利]一种检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒、标志物及方法

说明书

技术领域

本发明属于医学肿瘤学领域，具体涉及一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒、标志物及其检测方法。

背景技术

原发性肝癌是世界上恶性成度极高，且预后极差的恶性肿瘤之一，全世界每年约100万人死于肝癌。据统计中国乙肝病毒携带者约一亿多人，而每年新增加肝癌患者约45万，在城市发病率仅次于肺癌，是威胁人们生命的第二大恶性肿瘤“杀手”。肝癌是一种恶性肿瘤，癌细胞转移是它的特性之一。肝癌的转移有四种途径，即血路、淋巴道、直接蔓延、浸润或种植。其中以血行转移最为重要。肝内血行转移发生最早，也最常见，肝细胞型肝癌以血行转移多见，通过血行转移至全身各部，以肺、肾上腺、骨、肾、脑等器官较为常见。大量临床实践证明，恶性肿瘤的预测，关键在于是否能做到早发现、早诊断，而目前肿瘤只有争取早期治疗，才有可能被彻底治愈。早期发现肝癌意义重大，了解并掌握如何早期发现肝癌对肝癌的治疗、预后及降低病死率、延长寿命等方面可谓发挥着很关键的作用。

肝脏是鸟氨酸循环的重要器官。鸟氨酸循环又称“尿素循环”，是机体对氨的一种解毒方式。它的重要生物学意义是将体内蛋白质代谢产生的较高毒性的氨转化为低毒的尿素，从而排出体外。肝脏是哺乳类动物生成尿素的主要器官，由于精氨酸酶的作用使精氨酸水解为鸟氨酸及尿素。而精氨酸代琥珀酸合成酶(ASS)和精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)是鸟氨酸循环的关键酶。临床氨基酸分析121例肝癌患者血清和85例正常血清，发现肝癌患者血清精氨酸含量为(41.29±12.25μmol/mL)，正常人血清精氨酸含量为(107.38±11.61μmol/mL)，数据显示两者差异明显(P＜0.05)，表明肝癌患者精氨酸合成障碍。免疫组化和Western blot的方法研究肝癌与精氨酸代琥珀酸合成酶(ASS)及精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)之间的关联，结果显示精氨酸代琥珀酸合成酶(ASS)和精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)在肝癌组织中的表达与正常组织相比明显下调。

通过进一步的研究发现肝癌ASS基因和ASL基因的启动子区域CpG岛呈高度甲基化状态，CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，以致于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的失活，这是癌症发生的一个重要机制。一些基因的过甲基化成为肿瘤乃至癌细胞形成的标志物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒。

本发明的目的还在于提供一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的标志物。

本发明的目的还在于一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的方法。

一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒，包括dNTP、10xPCR buffer、MgCl₂、ddH₂O，其特征在于，还包括标准血液DNA、热启动TaqDNA聚合酶、引物F 1、引物B1、引物F2、引物B2、引物B3、引物R1、引物L1、引物R2、引物L2、引物L3；上述引物用于做甲基化特异性PCR，PCR时，引物的配对方案为：

引物F1、B1配对，引物F1、B2配对，引物F2、B1配对，引物F2、B3配对，用于检测ASS基因(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)甲基化情况；

引物R1、L1配对，引物R1、L2配对，引物R2、L3配对，用于检测ASL基因(GeneBank NG_009288，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)甲基化情况。

所述标准血液DNA为取自无肝癌健康人血液提取的基因组DNA并经过重亚硫酸盐处理。

引物F 1具有序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，引物B1具有序列表中SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，引物F2具有序列表中SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，引物B2具有序列表中SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，引物B3具有序列表中SEQ ID No.10所示的核苷酸序列，引物R1具有序列表中SEQ ID No.11所示的核苷酸序列，引物L1具有序列表中SEQ ID No.12所示的核苷酸序列，引物R2具有序列表中SEQ ID No.13所示的核苷酸序列，引物L2具有序列表中SEQ ID No.14所示的核苷酸序列，引物L3具有序列表中SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。