[发明专利]一种用模式生物斑马鱼筛选中药毒性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用模式生物斑马鱼筛选中药毒性的方法，属于医药技术领域。

背景技术

斑马鱼是一种用于生长发育和遗传研究的重要模式生物，在过去20年已经成为一种研究胚胎发育的重要模式生物。目前斑马鱼已经获得较为完整的基因组学、分子遗传学和胚胎学的资料，并被广泛应用于环境毒物的监测，已经被用于环境中许多化学物质如有害重金属、农药以及卤代芳香烃化合物等致癌物的累积效应和毒性研究。斑马鱼胚胎和幼鱼体积很小，可用微孔培养板培养，故其适合于高通量筛选。同时斑马鱼属于脊椎动物，是一种活体研究体系，可保留药物的代谢动力学过程，故其与其他的体外研究体系相比更加适合用于中药这种复杂化学体系的药效学和毒性筛选。斑马鱼的受精卵或者鱼苗能够便利地从培养介质中吸收亲水或亲脂的物质，使得其检测中药的活性变得非常方便。

当前，采用斑马鱼进行中药药效筛选模型有一些报道，但是进行毒性筛选的研究报道较少，即使有部分报道和相关研究性的模型，但是缺乏相关的研究数据评估该模型的适宜性和可靠性，并成为成熟和认可的毒性筛选模型。

发明内容

本发明的目的是提供一种易操作、准确度高的一种用模式生物斑马鱼筛选中药毒性的方法。

本发明可以通过下列步骤来实现：

(1)将中药药材粉碎或者提取或者直接已经成药的中药复方。

(2)根据初步的预实验，将样品溶于水中，配制成不同的浓度供试液。

(3)试验时挑选大小相近、健康活泼的斑马鱼，随机投入到干净的玻璃缸中(每缸中12条)，在试验期过程中不喂食，以避免饲料的影响，实验窜温度为(20±2)℃。试验开始后持续观察4h，同时在120h内不定时观察，至少每6h观察1次，发现死鱼及时捞出，

(4)当鱼苗中毒停止呼吸以后，用小镊子夹鱼尾柄部，10分钟内鱼苗不出现反应，则判断为死亡，计算各组斑马鱼累计死亡率并作记录。以寇氏法计算LC50及95％可信限。

(5)根据LC50进行毒性分级口：LC50＜1.0mg，剧毒；LC50＝1.0～100.0mg，高毒；LC50＝100.0～1000.0mg，中等毒性；LC50＝1000～10000.0mg，低毒；LC50＞10000.0mg，微毒(无毒)。

在步骤(1)中，所用的原料可以为药材粉末、中药提取物、中药浸膏、中药处方以及中药单体。

在步骤(2)中，所用的溶剂可以为水，也可以为二甲亚砜。

在步骤(3)中，所用的斑马鱼可以为斑马鱼，也可以为斑马鱼的受精卵或者胚胎；每个缸中的鱼的头数可以根据需要，调整为1～100条。

在步骤(4)中，判断与死亡的方法可以为3～15min；对于采用受精卵试验时，试验时观察陪她是否凝结、外包是否完成、有没有主动运动、水肿、色素、孵化是否延迟以及死亡等现象，以此判定药物对胚胎发育过程的影响以及毒性。

与其他检测方法相比，本发明的有益效果如下：(1)方法操作简便、实用性强；(2)初步判断出该中药的毒性，速度快，精确度高。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但本发明不仅限于所述实施例。

实施例1：

取麻黄药材，经处理后碾磨成粉状，过60～120目筛子，用干净粉按照10g/L溶于蒸馏水中，室温浸泡24小时后，用纱布过滤，取脱氯自来水配制成试验所需要的浓度组备用。

取当年生斑马鱼，体重0.28～0.35g/条，体长2.75～3.25厘米。将斑马鱼至于盛满脱氯水的玻璃缸中，早晚定时投喂专用鱼饲料1次，试验前24h停止喂食。将各组不同浓度待测的麻黄溶液至于玻璃缸中，将斑马鱼随即投入到各个盛药的玻璃缸中，每个缸中10条，整个试验期间不喂食，试验温度为22度，试验后开始观察，每6小时观察以此，观察96小时，发现死于及时捞出，并做好记录。

结果：将斑马鱼投入不同浓度的药液组后，均未见鱼苗跳出水面等刺激症状或者游动变缓的中毒症状。随着时间的推移，在500mg/L的浓度鱼苗于17h后发现中毒症状，鱼苗游动缓慢，鱼体摆动显得笨拙，时而缓慢沉入水底，时而腹部朝上。直至最后死亡，开始出现死亡的时间是18小时。各试验组死亡数随着药物浓度的变化和时间增加而上升，对照组则无死亡。具体数据见下表1。

表1  麻黄对斑马鱼的急性毒性死亡率