[发明专利]一种痘苗病毒穿梭载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种痘苗病毒穿梭载体及其应用。

背景技术

消灭天花是人类医学史上最伟大的成就，此过程中痘病毒起了决定性的作用。而痘苗病毒作为痘病毒科正痘病毒属的一员，是目前已知结构上最为复杂的一种病毒，其作为预防天花的疫苗已经使用了200多年，也是当前世界各国用来预防天花的储备疫苗。痘苗病毒天坛株(vaccinia virus Tian Tan，VTT)是中国特有的痘苗病毒毒株，曾作为预防天花流行的疫苗株在我国大量人群中长期使用过，其具有相对毒力较弱、使用安全的特点，是研制适用于中国应用的基因工程活病毒载体疫苗的理想毒株。

随着基因工程和分子生物学技术的发展，在对痘苗病毒进行不断研究和解析的基础上，该病毒在医学和生物学领域的应用不断深入。特别是1982年，Paoletti和Moss研究组首次成功应用痘苗病毒作为载体在哺乳动物中表达外源基因以来，该载体被广泛用于外源基因的表达调控、新型多肽、基因工程亚单位疫苗以及重组活病毒载体疫苗的制备研究。1987年，表达狂犬病病毒G基因的重组痘苗病毒首先获准在野生动物中使用，并成功控制了欧洲和北美地区野生动物狂犬病；1990年表达新城疫病毒F基因的重组痘苗病毒在美国注册；1994年表达新城疫病毒HN和F基因的重组痘苗病毒作为首个基因工程活载体疫苗在美国获准批量生产。随着重组痘苗病毒在兽医药领域的成功应用，人们开始将目光投向其医用价值。1996年美国启动了用于治疗恶性黑色素瘤的重组痘苗病毒Aldesleukin的I期临床试验，并于2001年完成了该项目的II期临床试验；2003年用于预防艾滋病的重组痘苗病毒ITV完成了I/II期临床试验。目前，全球仍有百余项以重组痘苗病毒为生物制剂的研究处于医学临床试验阶段，涉及癌症、艾滋病、肝炎、疟疾和结核等多种疾病的预防和治疗领域。

用痘苗病毒(vaccinia virus，VV)作为真核表达载体，与其他哺乳动物病毒表达载体如逆转录病毒、人单纯疱疹病毒和腺病毒等相比，具有自身独特的优势，主要表现在：①包装容量大，痘苗病毒基因组中有许多复制非必需基因，约占整个开放阅读框的15％，它们的缺失并不影响病毒在细胞中正常的复制周期，所以其可以插入总量达25kb的外源基因，具有很大的包装容量，并且插入的外源基因可以稳定的遗传和表达；②免疫原性高，外源蛋白在宿主细胞内能被忠实表达，并能进行正确的翻译后加工和修饰，表达的蛋白具有完全天然的构象和生物学活性，可诱导机体产生长效的细胞免疫和体液免疫；③安全性高，严格的胞浆内复制，不与宿主细胞的基因组整合，无致癌性，这消除了重组痘苗病毒应用后的遗传威胁；④宿主范围广，痘苗病毒能感染包括人、鼠、猪、狗、猴、兔、鸡等在内的大多数哺乳动物和禽类，也可以在相应的细胞系中繁殖；⑤易于构建多价疫苗，在痘苗病毒不同的非必需区可同时插入不同的外源基因，这些基因之间的表达相互独立，彼此不受干扰，因此，痘苗病毒特别适合构建多价疫苗，以实现不同有效成分的组合来提高疫苗的保护效率；⑥操作简便，不需要辅助病毒或包装细胞；⑦作为预防或治疗性生物制剂的安全性和有效性已被大量的动物和人体试验证明。

鉴于此，构建稳定、高效、安全的痘苗病毒表达载体具有重要的意义。由于痘苗病毒基因组十分庞人，且其DNA不具有感染性，因而不能通过直接的基因剪切方法将外源目的基因导入痘苗病毒的基因组。利用携带目的基因的穿梭载体在感染痘苗病毒的细胞中与痘苗病毒进行同源重组成为获得重组痘苗的通用和主要方法。因此，痘苗病毒穿梭载体的构建是重组痘苗病毒制备的基础和关键点。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够同时且高效表达至少三种外源基因的重组痘苗病毒穿梭载体。

本发明的另一目的是提供上述痘苗病毒穿梭载体在基因工程活病毒载体疫苗、多肽及亚单位疫苗制备及生物制药中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种痘苗病毒穿梭载体，其含有根据痘苗病毒胸苷激酶基因TK及其侧翼序列设计的同源重组臂TKL和TKR，在TKL和TKR之间存在有3个或3个以上的多克隆位点，每个多克隆位点的两端分别连有PE/L启动子和T5nT终止子，所述穿梭载体还含有大肠杆菌复制起始位点pUC ori和抗性筛选标记。

前述的穿梭载体，其出发载体为pBluescipt Sfi。

前述的穿梭载体，所述抗性筛选标记为氨苄青霉素抗性基因。

前述的穿梭载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述痘苗病毒穿梭载体的制备方法，包括步骤：