[发明专利]柱层析法从组分I中提取人纤维蛋白原的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别是一种柱层析法从组分I中提取人纤维蛋白原的方法。

二、背景技术

人纤维蛋白原(Human Fibrinogen)即人凝血因子I，是血浆蛋白的主要成份之一，分子量约为34万，等电点5.5，加温至57℃很快变性。它在血浆中的含量高，约为2-4g/L，是血浆粘滞性的主要决定因素，肝脏是合成纤原的主要场所。

人纤维蛋白原(Fg)能迅速提高血液中纤维蛋白原的含量，通过凝血酶的作用，使纤维蛋白原转化为不溶的纤维蛋白，网络血液中血球等有形成分凝成血块，达到止血的目的。用于治疗产后大出血和因大手术、外伤或内出血等引起的纤维蛋白原缺乏而造成的凝血障碍，以及胸廓、腹部和尿路等大型外科手术的出血等，对治疗血友病的合并症也有效。

由于血浆中纤维蛋白原含量十分丰富，并且纤维蛋白原分子量很大，所以纤维蛋白原较易从血浆中分离提纯，而且该产品临床需求量也较大，因此分离纯化人纤维蛋白原，不仅提高宝贵血浆资源的综合利用，同时在医药卫生方面也有较大意义。

人纤维蛋白原是已有国家标准的的血液制品，收录在2010年版《中国药典》三部中，该药在国内已经临床使用多年，其生产工艺已比较成熟，近年也有专利申请号为200810046747.5和专利申请号为200910237204.6的人纤维蛋白原的生产方法，但目前国内外大多数血液制品厂家基本上都采用低温乙醇法以血浆为原料，从Cohn6法的组分I中提取人纤维蛋白原，该法主要缺陷为制品的纯度较低，一般70～80％，外观较差，质量稳定性差。也有报导从冷沉淀中提取人纤维蛋白原，由于冷沉淀中的纤维蛋白原的含量较低，产品最终收率没有从FI高，并且冷沉淀是作为人凝血因子VIII的起始原料，如果用于生产人纤维蛋白原，势必降低人凝血因子VIII的生产量，收率低。因此，人纤维蛋白原的制备方法亟待改进和创新。

三、发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明的目的就是提供一种柱层析法从组分I中提取人纤维蛋白原的方法，可有效解决人纤维蛋白原纯度高，稳定性好，收率高的问题。

本发明解决的技术方案是，由以下步骤实现：

(1)组分I沉淀的溶解及过滤：沉淀用5～15倍体积的第一溶解液，20-26℃搅拌溶解1小时，溶解后的制品澄清过滤，计量制品体积；

(2)S/D灭活：将制品温度控制在24～26℃，按每升滤液加100ml的比例，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度的11％S/D溶液，保持制品温度24～26℃6小时；

(3)第一次甘氨酸沉淀：计量步骤2中灭活液体积，按1.5～2.2mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至2～8℃，以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，设定温度0℃，收集沉淀；

(4)一次沉淀的溶解及过滤：沉淀用5～10倍体积的第二溶解液，在20-26℃搅拌溶解1小时，溶解后过滤，收集滤液；

(5)柱层析：DEAE-650M凝胶先用枸橼酸缓冲液平衡，再将步骤(4)中的滤液上柱进行层析，收集流出液，层析结束后用3倍柱床体积的枸橼酸缓冲液洗涤凝胶，并入流出液中；

(6)第二次甘氨酸沉淀：层析流出液按1.5～2.2mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至2～8℃，用离心机以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，-5℃收集沉淀；

(7)二次沉淀的溶解及过滤：沉淀用3～5倍体积的第三溶解液，室温溶解1小时，溶解后，过滤；

(8)配制：检测过滤后制品蛋白质含量，根据蛋白质含量用第三溶解液进行配制，使最终制品中蛋白含量为25g/L；

(9)分装及冻干：配制后制品除菌分装于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分装后冻干；

(10)干热灭活：步骤9中冻干后制品置于水浴中，保持水浴温度100℃，30分钟。

该方法是采用柱层析技术并结合甘氨酸沉淀法从组分I(FI)中提取人纤维蛋白原，该生产工艺中采用的甘氨酸沉淀法比传统的低温乙醇沉淀法条件温和，能够保证制品的活性和制品的稳定性，加入了DEAE-650M凝胶吸附过程，能够吸附生产过程中夹带的其它凝血因子，进一步保障了制品的稳定，以组分I作原料能够提高每升血浆人纤维蛋白原收率。该法采用甘氨酸作为沉淀剂，使最终制品中夹带有0.5％左右的甘氨酸，甘氨酸与盐酸精氨酸联合作为制品稳定剂，能够增强制品冻干后的稳定性。所以该生产工艺能够提高制品的质量，纯度、稳定性和最终产品的收率，是制备人纤维蛋白原的创新。

四、附图说明

图1为本发明的制备工艺流程图。