[发明专利]肝癌组织中具备致瘤潜能的细胞团的分离方法

权利要求书

1.一种临床肝癌样本中样本能够维持肝癌特性的细胞团的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）收集临床标本，利用机械分离和透明质酸酶、IV型胶原酶和DNA酶联合消化制备组织团和细胞悬液；

（2）将组织团和细胞悬液稀释先后用100um和40um孔径的滤网过滤，分别收集能通过40um滤网的细胞悬液和能通过100um滤网而不能通过40um滤网的细胞团；结合苔盼蓝染色方法细胞计数和统计细胞成活率，能通过40um孔径滤网的组分以单细胞为主要组分，能通过100um滤网而不能通过40um滤网组分为9-29（23.8±6.9）个细胞组成的细胞团；

（3）与能通过40um孔径滤网的以单细胞为主要组分的细胞悬液相比，能通过100um滤网而不能通过40um滤网的细胞团在体外原代培养中表现出明显显著的体外生长能力、耐药能力和克隆形成能力；

（4）通过100um滤网而不能通过40um滤网的组织细胞团，从原代培养得到传代细胞与病理标本在抗人Hepatocyte、CK18、CK19和CD133等蛋白的表达上基本一致。

2.根据权利要求1所述临床肝癌样本中样本能够维持肝癌特性的细胞团的分离方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述制备组织团和细胞悬液，其实施步骤为：

（1.1）手术完成后30分钟内取Edmondson-Steiner病理分级确定为Ⅱ-Ⅲ级肝癌组织1-2cm³置于预冷4℃无钙镁 HBSS离心管中；

（1.2）生物安全柜内用组织冲洗液冲洗5遍，在该溶液中除去白色纤维状组织、血凝块、组织碎片及明显坏死的组织后，取1.2-1.6g组织块，利用无菌眼科剪分解成1mm³大小组织块，转移至50ml无菌离心管中，加组织冲洗液至50ml，混匀，4℃ 500rpm离心10分钟，弃上清；

（1.3）按15ml/g组织加入预热至37℃的消化液，37℃消化1小时，间隔10分钟轻柔混匀消化液30秒。

3.根据权利要求1所述临床肝癌样本中样本能够维持肝癌特性的细胞团的分离方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述分别收集能通过40um滤网的细胞悬液和能通过100um滤网而不能通过40um滤网的细胞团，其实施方法为：

（2.1）按照消化液1:1-2体积添加4℃预冷组织冲洗液至总体积为50ml，悬液通过100um滤网除去未消化的组织块；得到悬液用40um滤网继续过滤，收集40um滤网滤过溶液，用4℃组织冲洗液收集和重悬滤网上的组织块；

（2.2）40um滤网滤过悬液和滤网上组织块用4℃预冷组织冲洗液15ml重悬，500rpm离心10分钟，弃上期，用组织清洗液5ml重悬沉淀；

（2.3）得到成分为两组：能通过40um的细胞悬液和能通过100um滤网而不能通过40um滤网的组织细胞团。

4.根据权利要求1所述临床肝癌样本中样本能够维持肝癌特性的细胞团的分离方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述体外原代培养，获得组分体外原代培养的方法为：

（3.1）培养器皿利用鼠尾胶原预包被，参照细胞计数结果和成活率统计，利用细胞培养液将权利要求1步骤1）得到的两种组分调配成成含活细胞浓度为2×10⁶/ml的悬液，按10⁶/cm²浓度接种至鼠尾胶原预包被的培养皿中；

（3.2）静置15-30分钟后小心吸去培养皿上层细胞培养液，根据培养皿面积大小不同按照0.05-0.1ml/cm²比例小心地沿培养皿边沿加入新鲜细胞培养液；CO₂培养箱37℃培养30-90分钟待细胞贴壁（60%以上），间隔30分钟观察并按照0.05ml/cm²比例添加新鲜细胞培养液；

（3.3）细胞完成贴壁后按0.5ml/cm²添加新鲜细胞培养液，12小时后换液去除死细胞或未贴壁细胞，按1ml/cm²加入细胞培养液，后续培养间隔2-3天后换液。

5.根据权利要求1所述临床肝癌样本中样本能够维持肝癌特性的细胞团的分离方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述从原代培养得到传代细胞，从原代培养得到传代细胞的方法为：

（4.1）细胞培养皿或洁净无菌载玻片利用鼠尾胶原预包被；

（4.2）待细胞生长至铺满培养皿表面，利用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化后成单细胞后，加入细胞培养液终止消化，接种到鼠尾胶原预包被的培养皿或清洁无菌的载玻片；

（4.3）细胞贴壁后更换，后续培养中2-3天更换细胞培养液。