[发明专利]肝癌组织中具备致瘤潜能的细胞团的分离方法

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤组织细胞和肿瘤组织细胞原代培养领域，尤其涉及一种肝癌临床标本中性状相对稳定的高生长增殖和致瘤能力及高耐药能力的肝癌细胞亚群的体外获取方法。

背景技术

目前认为肿瘤细胞具有异质性（heterogeneous），其中少量癌干细胞，表现出更强的生长增殖、致瘤性和对抗肿瘤药物的耐受能力，是肿瘤形成和维持以及治疗后复发的源头细胞，找到这些细胞并确定其细胞生物学特点有助于发展新的诊疗方案实现恶性肿瘤的早期诊断和靶向治疗方案，降低其发生率和致死率。

1997年发现粒细胞性白血病中存在能在免疫缺陷鼠体内大量扩增的白血病干细胞亚群，实体瘤癌干细胞便成了研究者搜寻的目标。2003年，Al-Hajj等报道的人乳腺癌干细胞和Singh等报道的人脑瘤干细胞为这一研究拉开了序幕。随后，在肺癌^]、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和肝癌等恶性肿瘤中先后报道了少量细胞亚群表现出癌干细胞特性。以往的研究发现原发性肝癌组织及相关组织中，能检测到CD133表达于肝硬化假小结外周的卵圆或立方形的肝细胞，或汇管区附近由胆管上皮细胞和肝细胞过渡区域的与成熟肝细胞相比体积较小的细胞，这些细胞符合肝干细胞的结构特点；而肝癌细胞系中CD133⁺细胞表现出更强的致瘤性，因此认为CD133⁺细胞是肝脏癌变的起源细胞(tumor initiating cell)，或癌干细胞样细胞（Cancer stem-like cell），CD133是肝癌干细胞的表面标志得到多家研究机构的认同。与此同时，肝癌细胞系中的侧群细胞（Side Population）表现出的癌干细胞样特征也被报道。随后，研究者在肝癌细胞系中报道了根据不同方法得到的细胞亚群具有肝癌干细胞(Cancer Stem Cell)或癌前体细胞（HCC progenitor-like cells）特性，如CD90+肝癌细胞，OV-6⁺和内源性Wnt/β-Catenin活化的肝癌细胞，表达胰岛素样生长因子-1受体和表皮生长因子受体的肝癌细胞，Epcam⁺肝癌细胞及CD13⁺细胞等。而在CD133⁺细胞群内，研究者又分别分离出ALDH⁺或CD44⁺的细胞在其表现出的癌干细胞特性中扮演了更加重要的角色。虽然众多关于肝癌干细胞的报道让其真实面目扑朔迷离，但其中存在更强生长增殖、致瘤和耐药能力的细胞亚群得到越来越多的支持证据，而细胞表面表达CD133的细胞亚群得到了多家机构研究结果的支持。

目前大部分关于癌干细胞的研究结果都是基于已经建成的肿瘤细胞系，尤其是肝癌干细胞研究更是主要集中于在肝细胞癌细胞系筛选具有更强致瘤性的细胞亚群，对癌干细胞特性的主要考量是其致瘤性，即分选细胞后进行体外成瘤实验或免疫缺陷鼠体内成瘤实验。我国HBV发病率高，相关的肝癌发病率和致死率都非常高，结合肝癌临床样本寻找肝癌干细胞为临床治疗提供参考是非常切实意义的工作。而临床肝癌样本大多伴有较严重的肝纤维化，难以获得活力和数量足够的细胞来完成分选和必要的鉴定，难以在此基础上分离鉴定具有肝癌干细胞特性的细胞亚群。以往的研究表明，即便是癌旁肝组织，接种免疫缺陷鼠BNX皮下能够观察到肿瘤结节的形成，这提示其中存在具有致瘤性能力的功能单位，而需要对目前分离和鉴定肝癌干细胞的策略进行适当的调整。

根据干细胞与其生长的微环境（Niche）的关系，研究者认为癌干细胞至少应该具备自我更新、分化和归巢等基本特性，而正是这些特性造成癌干细胞表现出肿瘤生成和耐药等细胞生物学行为，而癌干细胞所有基本特性和表现行为受其Niche对它的支持和调控。肝细胞癌干细胞生长Niche特异性结构目前虽然尚无定论，纤维化是HBV相关的肝癌病程中的一个重要环节，成纤维细胞被认为在肝癌的病程具有非常重要的支持作用。但目前得到广泛认同的其中存在支持肝癌干细胞生长的niche。临床样本中分离得到的单个肝癌细胞在传代过程中分化和难以观察到致瘤能力的原因可能是因为被消化过程损伤或离开支持和调控其生长的微环境相关。

因此，分离具有一定数量细胞的细胞团，如果能获得在体外生长增殖、致瘤性和耐药等特性上具有一定优势，并且其传代细胞能够表现出与原始标本比较一致的性状，可以为从临床肝癌样本中分离和鉴定肝癌干细胞提供基础。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种肝癌组织中具备致瘤潜能的细胞团的分离方法。