[发明专利]一种优化的siRNA阳离子脂质体的处方组成

说明书

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及siRNA阳离子脂质体的处方构成中含有特定比例的1，2-二油酰基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)和N-羧基-聚乙二醇2000-1，2-二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺(cPEG-DSPE)，得到一种能有效转运siRNA至细胞质的脂质体处方。

背景技术

RNA干扰(RNAi)是指双链RNA对基因表达的阻断作用，双链RNA经dicer酶切后会形成很多小片段，称为siRNA(小段干扰RNA)，这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”(不能表达功能)。

siRNA可经由多种不同转染技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的敲弱效果，因此可利用经过适当剪裁的siRNA之互补性，来沉默肿瘤细胞内相应的基因蛋白质。目前限制siRNA应用的主要问题是如何把siRNA转运至细胞质，裸核酸分子具有分子量大、亲水性及表面电荷呈负性等性质，使其易于被网状内皮系统(RES)所清除，难以进入细胞。阳离子脂质体通过电荷作用可以有效地使带负电的siRNA与脂质体结合，保护siRNA免受核酶降解，并且易于与带负电的细胞表面结合，触发细胞内吞摄取。

生存素(survivin)蛋白是凋亡抑制蛋白成员之一，具有强大的抗细胞凋亡作用，并在维持细胞有丝分裂及血管形成调控过程中起重要作用，是致癌过程的重要因素。因此可利用生存素siRNA干扰技术沉默生存素基因，通过阳离子脂质体介导将生存素siRNA转染入肿瘤细胞的细胞质，抑制生存素蛋白的表达。

CN200710072417.9公开了一种siRNA脂质体的制备方法，选用鱼精蛋白与siRNA先结合形成复合物包埋在中性脂质体中，提高了脂质体的稳定性和包封率，降低了细胞毒性，但并未描述该中性脂质体是否成功将siRNA转运至细胞质。

具有高表面电荷的阳离子脂质体通常会有一定的细胞毒性，因此需要控制阳离子脂质材料在脂质体中的用量；众所周知，聚乙二醇(PEG)修饰阳离子脂质体表面，降低了脂质体被RES清除的几率，提高了脂质体在血液系统的循环时间，从而使更多的脂质体通过增强的透过和滞留(EPR)作用进入肿瘤组织；另一方面，PEG增加了脂质体表面的亲水性，从而降低了脂质体在肿瘤间质中的转运和细胞摄取量；因此有必要研究阳离子脂质体中优化的PEG含量，同时兼顾EPR作用和细胞内生物利用度。摩尔含量为5％的PEG被广泛使用在各种脂质体制剂中，然而我们并不知道其是否能成功从内涵体逃逸，将siRNA转运至细胞质。

发明内容

本发明的目的是为了得到一种能有效转运siRNA至细胞质的阳离子脂质体处方组成。本发明siRNA脂质体的原辅料包括1，2-二油酰基-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)、胆固醇、1，2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-二棕榈酰基-3-磷脂酰胆碱(DPPC)、N-羧基-聚乙二醇2000-1，2-二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺(cPEG-DSPE)或N-甲氧基-聚乙二醇2000-1，2-二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)。

考虑到阳离子脂质体的细胞毒性，首先筛选出安全的DOTAP用量范围；然后进一步筛选出成功转运siRNA至细胞质的处方组成。选择肿瘤细胞内生存素蛋白的表达量作为研究对象，选择siRNA专用缓冲液作为阴性对照，标志细胞质内生存素蛋白表达的正常量；将不同处方的载生存素siRNA脂质体作用于细胞，选择相应的载非靶向siRNA脂质体作为阳性对照，证明细胞质内生存素蛋白表达的下调仅与生存素siRNA相关，与其他siRNA无关；筛选有效的载siRNA阳离子脂质体处方组成。

本发明首先采用本领域技术人员所熟知的脂质体制备方法(如薄膜分散法、液氮挥发法、逆相蒸发法、乙醇注入法、熔融法、超声法、聚碳酸酯膜挤出法等)制备空白阳离子脂质体，然后将空白脂质体与含siRNA的缓冲液按4∶1+/-电荷比混匀，放置适当时间后即得siRNA阳离子脂质体。

本发明通过下列步骤来描述siRNA阳离子脂质体的制备：

1、采用本领域技术人员所熟知的脂质体制备方法制成空白阳离子脂质体。其中含有25％-51％(相当于摩尔含量20％-40％)的DOTAP和0％-5％(相当于摩尔含量0％-1％)的cPEG-DSPE或mPEG-DSPE。