[发明专利]针对三种甘薯病毒的融合基因及其干涉载体

说明书

 

技术领域

本发明涉及甘薯病毒的基因和干涉载体，属于生物工程技术领域，特别是涉及针对三种甘薯病毒的融合基因及其干涉载体。

背景技术

甘薯是重要的粮食、饲料、工业原料和新型能源作物，近年来甘薯的用途越来越受到人们的关注。甘薯病毒病是影响甘薯生产的重要限制因素之一，病毒病的感染可造成甘薯产量下降、品质变劣和种性退化，一般可减产30%-50%。甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯潜隐病毒（Sweet potato latent virus，SPLV）和甘薯G病毒（Sweet potato virus G，SPVG）是危害甘薯的三种主要病毒，这三种病毒分类上都属于马铃薯Y属（potyvirus）病毒。在田间这几种病毒常常混合侵染，对甘薯生产造成严重危害。对甘薯病毒病目前尚无特别有效的化学防治方法，利用基因工程技术构建RNA干涉（RNAi）载体，培育抗病毒转基因甘薯是防治病毒病危害的最有效方法之一。经检索，目前还未发现利用RNA干涉技术防治甘薯病毒病危害的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题：克服现有防治甘薯病毒病的缺点，提供一种针对三种甘薯病毒的融合基因，还提供了对三种病毒有明显干扰抑制作用的RNA干涉载体。

本发明的技术方案：

针对三种甘薯病毒的融合基因序列为SEQ1，命名为SPFLG。

三种甘薯病毒的RNA干涉载体，其构建方法包括以下步骤：

（1）引物设计：根据三种甘薯病毒外壳蛋白基因核苷酸序列的保守区域设计两对引物，具体如下：

SPFLG-XbaI：5'-CCTtctagaTACGAGCTGCATTCAACCAC-3'，

SPFLG-SpeI：5'-AGTactagtCTGCACACCCCTCATACC-3'；

SPFLG-KpnI：5'-CCTggtaccTACGAGCTGCATTCAACCAC-3'，

SPFLG-ClaI：5'-AGTatcgatCTGCACACCCCTCATACC-3'；

（2）甘薯病毒RNA干涉载体构建：

将权利要求1所述的SPFLG基因克隆到T载体上，命名为SPFLG-T，以SPFLG-T为模板，分别以SPFLG-XbaI和SPFLG-SpeI及SPFLG-KpnI和SPFLG-ClaI为引物，进行PCR扩增，将获得的目的基因SPFLG分别用XbaI和SpeI及KpnI和ClaI酶切后，以反向重复的方式分别克隆到pBlue NiRIntron载体的内含子两侧；然后利用XbaI和KpnI进行双酶切，回收含有反向重复目的基因的片段，将其克隆到中间载体pROK219上，所述含有反向重复目的基因的片段位于35S启动子的下游、NOS终止子的上游，命名为pROKSPFLG；用EcoRI和HindIII酶切pROKSPFLG，回收包括35S启动子、反向重复片段和NOS终止子的目的片段，克隆到植物表达载体pBIN19上，命名为pBINSPFLG。

所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸 40s，30个循环，最后72℃ 延伸10min。

所述三种甘薯病毒为甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒和甘薯G病毒。

所述的RNA干涉载体在防治病毒甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒和甘薯G病毒中的应用。

本发明的积极有益效果：

（1）本发明根据SPFMV、SPLV和SPVG三种病毒外壳蛋白基因核苷酸序列的保守区域设计两对引物，以质粒SPFLG-T为模板，将融合基因SPFLG以反向重复的方式克隆到pBlue NiRIntron载体的内含子两侧，再将含有内含子的反向重复片段插入到中间载体pROK219上，将包括35S启动子、反向重复片段和NOS终止子目的片段克隆到植物表达载体pBIN19上，成功构建了含有三种病毒CP基因保守区反向重复序列的RNA干涉载体。