[发明专利]高密度发酵高核热带假丝酵母生产核糖核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种搅拌罐高密度连续培养高产核酸热带假丝酵母(Candida lipolytica)的核糖核酸的生产方法。

背景技术

RNA是一类十分重要的生物大分子，它不仅在基因的表达和蛋白质的生物合成起着关键的作用，而且还能促进细胞的诸多生理功能。近年来一些研究表明RNA及其酶解物核苷酸具有维持机体免疫功能、抗氧化、提高机体蛋白质和铁的生物利用率、降低胆固醇和抗衰老等多种生理功能。

通过酵母发酵法制备RNA是目前RNA工业生产的主要方法。因此，高产核酸菌种的诱变筛选是实现工业化生产的基础。Shunichi等(US，3411989[P].1968-11-19)通过化学诱变的方式得到了指数生长期核酸含量达13％的高产RNA的热带假丝酵母。

随着核苷酸市场需求量的增大，核酸酵母培养技术得到了不断的发展，目前被用于工业化生产的微生物法产核酸的菌种主要有Saccharomyces cerevisiae和Candida tropicalis(US7,135,327B2[P].2006-11-14)。

一般酵母厂每升发酵液中酵母干菌体重在30g以下。因此优化培养条件达到高密度发酵一直是科学家以及很多企业追求的目标。

三木克哉等(JP，5-176757[P].1993-07-20)发表的专利报道了至今最高核酸生产水平，利用酿酒酵母进行发酵培养，达到干菌浓度30g/L，RNA含量达到了10％。我国福建莆田糖厂年产150吨RNA。干菌浓度可以达到15g/L，RNA含量达到12％，达到与日本生产工艺具有较大的差距。因此改变目前我国生产RNA的技术瓶颈，开发高密度，高RNA含量的酵母，且环境污染少的RNA，是实现绿色生产的必经之路。

发明人在前期研究中，通过将热带假丝酵母ATCC14246进行诱变筛选，得到一株高产核糖核酸的热带假丝酵母菌株，简称CPU-1，已于2009年12月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提交保藏，保藏号为：CGMCC No.3558，公开在CN101805704A专利文献中。同时，也实现了搅拌罐连续发酵热带假丝酵母生产RNA，菌体浓度达20～23g/L，核糖核酸含量达12～14％，装料系数达到50-75％，公开在CN101805771A。

但是，国内目前生产核苷酸发酵过程中最高菌体浓度最高只能达到23g/L，能耗相对比较大。

发明内容

本发明通过对搅拌发酵罐中发酵步骤的改革，使菌体浓度达33～36g/L和核糖核酸含量达12～14％，装料系数达到50-75％，同时通过连续发酵取代间歇发酵过程中的消罐、空消、进料、实消的工艺，大幅度提了单位发酵罐体积菌体及RNA的产量，降低能耗，减少了排放。该工艺减轻了劳动强度，简化了生产程序。

本发明的制备方法包括：将保藏号为CGMCC No.3558的菌种在斜面培养基中活化后摇瓶培养，将摇瓶所得菌种在搅拌发酵罐中发酵，提取分离核糖核酸即得，上述过程中在搅拌发酵罐中发酵过程为：先在发酵培养基中进行间歇发酵，3～8h后在不断加入补料培养基a和补料培养基b的情况下进行高密度发酵培养，当干菌浓度达到33～36g/L时，开始流加高密度连续发酵培养基进行高密度连续发酵，其中补料培养基a含250～350g/L糖蜜；补料培养基b含250～350g/L糖蜜、6～13g/L的硫酸镁、6～13g/L的尿素、1～4g/L的硫酸铵、0.5～3g/L的硫酸锌、0.5～3g/L的硫酸亚铁、0.3～1g/L的NaCl和10～30ml/L的磷酸。

在斜面培养基中优选以28～31℃培养24～36h。

斜面培养基优选含30g/L的葡萄糖、3g/L的牛肉膏、3g/L酵母膏、5g/L硫酸铵、0.1g/L无水硫酸亚铁和25g/L琼脂。

摇瓶培养基优选含35～45g/L糖蜜、1.0～1.4g/L的硫酸镁、1.0～1.4g/L的尿素、0.1～0.5g/L的硫酸铵、0.05～0.3g/L的硫酸锌、0.05～0.3g/L的硫酸亚铁、0.05～0.2g/L的NaCl和1～3ml/L的磷酸。